长期施肥和温度对酸性旱地土壤硝化微生物和总细菌群落的影响

摘要

我国酸性土壤总面积高达2×108hm2，约占全国土壤面积的23％，其中一半以上土壤为农业土壤或具有潜在的农业价值，随着人类对土地利用效率和农业经济效益的需求增加，农业生产伴随着大量肥料的投入，但经济作物对氮肥的利用率却普遍低于40％，氮肥的过量投入导致土壤氮循环失衡，加剧了土壤酸化，降低了农业经济效益。硝化作用是土壤氮循环的重要过程，由硝化微生物驱动，其中氨氧化过程是硝化作用的限速步骤。然而，氨氧化微生物在酸性条件下对土壤硝化作用的影响尚存争议，土壤硝化作用强度及氨氧化微生物对其的相对贡献受多个环境因子的综合调控，长期施肥酸性旱地土壤的土壤硝化作用及其功能微生物的季节演变尚不明确，此外，长期施用无机肥和有机肥对酸性旱地土壤总微生物群落多样性影响也不尽相同。
　　因此本研究选用江西进贤红壤研究所长期定位施肥30年酸性旱地土壤为研究材料，选用(1)不施肥(CK)、(2)施氮磷钾无机肥(NPK)、(3)施腐熟猪粪有机肥(OM)三种处理，构建实验室微域培养实验与原位土壤分析实验，通过添加硝化抑制剂的短期培养并联用定量PCR(Quantitative PCR，qPCR)、变性梯度凝胶电泳（Denaturing Gradient Gel Electrophoresis，DGGE）及Illumina MiSeq高通量测序等分子生态学技术，分析培养过程中发挥硝化活性的、且占据活性优势的硝化微生物类群，探究自养硝化微生物群落及活性特征并认知其与土壤理化因子间的关系，明确长期施肥酸性旱地土壤硝化活性的季节演变特征以及酸性旱地土壤中氨氧化古菌（Ammonia-oxidizing archaea，AOA）和细菌（Ammonia-oxidizing bacteria，AOB）在不同培养温度下对氨氧化过程的相对贡献，研究长期施无机肥和有机肥对酸性旱地土壤中总微生物群落多样性的影响，比较二者影响的异同，分析影响群落变化的主要环境因子。
　　结果显示，施肥对土壤理化性质有显著影响，供试土壤自养硝化作用占总硝化速率的73.60％～85.32％，施肥显著提升土壤自养硝化活性，其中施有机肥提升效果更为明显;OM土壤氨AOA和AOB amoA基因绝对丰度及16S rRNA基因相对丰度显著上升，而CK和NPK土壤仅AOA相对丰度显著上升，即3种土壤AOA均有明显活性（主要类群为Nitrososphaera，＞99.30％），而AOB仅在OM土壤有活性（主要类群为Nitrosospira，＞99.99％），另外还发现OM土壤中亚硝酸盐氧化细菌(NOB)有较强活性（主要类群为Nitrospira，＞96.69％）;逐步回归分析显示自养硝化活性与总氮含量显著正相关，AOA和AOB amoA基因丰度分别受有机碳含量和pH的显著影响，Nitrososphaera相对丰度与NO3--N含量显著正相关，而Nitrosospira和Nitrospira相对丰度则与C/N显著负相关。在4℃～23℃土壤硝化活性较低，CK、NPK和OM土壤的最高土壤硝化速率分别为2.29mg·(kg·d)-1、6.00mg·(kg·d)-1和11.58mg·(kg·d)-1，而在夏季23℃～35℃土壤硝化活性最高，三种土壤的最高土壤硝化速率分别为5.19mg·(kg·d)-1、7.62mg·(kg·d)-1和14.25mg·(kg·d)-1。CK、NPK和OM土壤中AOB贡献的自养硝化作用分别在28℃、18℃和18℃达到峰值，AOA贡献的自养硝化作用均在35℃达到峰值。随着温度的上升，AOA对自养硝化作用的贡献逐渐上升并占据主导，施无机肥和有机肥未改变土壤AOA的对温度的响应，但AOB活性最高温度显著降低。C8H14作为土壤硝化抑制剂其抑制效果与施加浓度正相关，选用0.5％的添加浓度作为区分CK和NPK土壤中AOA和AOB对土壤硝化作用的相对贡献时效果最佳。相较于长期施化肥，长期施有机肥显著改变了酸性红壤的细菌群落组成和多样性。ABT（Aggregated Boosted Tree）分析发现土壤pH是细菌群落的总重要的环境因子。此外，施有机肥显著改变了例如代谢和遗传基因信息处理等代谢途径和功能基因的相对丰度。结果显示施有机肥对土壤酸碱度调节有着重要影响，进而改变了长期施肥酸性旱地土壤的微生物群落组成和多样性。
　　本文对施肥驱动下的酸性旱地土壤硝化微生物群落演变规律的研究，为认识自养硝化微生物生理代谢多样性及生态功能提供了实验数据，也为酸性旱地土壤施肥管理提供参考。

目录

声明

摘要

第1章 文献综述

1．1 酸性土壤及其农业利用

1．1．1 我国酸性旱地土壤概况

1．1．2 施肥对土壤性质及生态功能的影响

1．1．3 季节对土壤性质及生态功能的影响

1．2 土壤硝化作用及其功能微生物

1．2．1 土壤硝化作用

1．2．2 土壤硝化微生物及其在酸性土壤中的地位

1．2．3 施肥对土壤氨氧化微生物及其活性的影响

1．2．4 温度对土壤氨氧化微生物及其活性的影响

1．3 施肥驱动下的微生物群落演变规律

1．3．1 施无机肥对土壤微生物的影响

1．3．2 施有机肥对土壤微生物的影响

第2章 研究背景与研究内容

2．1 研究目的与意义

2．2 研究地概况

2．3 研究内容与技术路线

2．3．1 研究内容

2．3．2 技术路线

2．3．3 拟解决的科学问题

第3章 长期施肥酸性旱地土壤硝化活性及自养硝化微生物特征

3．1 前言

3．2 材料与方法

3．2．1 土样处理与理化性质测定

3．2．2 土壤氨氧化潜势测定

3．2．4 土壤总DNA提取及amoA基因丰度测定

3．2．5 氨氧化微生物的PCR-DGGE分析

3．2．6 MiSeq高通量测序分析

3．2．7 数据分析

3．3 结果与分析

3．3．1 长期施肥处理土壤基本理化性质

3．3．2 微域培养过程中土壤无机氮含量变化

3．3．3 微域培养过程中土壤AOA和AOB群落丰度变化

3．3．4 微域培养过程中土壤硝化微生物群落组成变化

3．3．5 长期施肥土壤硝化活性及硝化微生物群落变化的环境因子分析

3．4 讨论

3．4．1 长期施肥对酸性旱地土壤硝化活性的影响

3．4．2 长期施肥对酸性旱地土壤自养硝化微生物的影响

3．5 结论

第4章 温度对酸性旱地土壤硝化微生物及活性的影响

4．1 前言

4．2 材料与方法

4．2．1 土样处理与理化性质测定

4．2．2 土壤氨氧化潜势测定

4．2．3 培养温度的设置

4．2．4 抑制剂浓度的设置

4．2．5 土壤微域培养及样品采集

4．2．6 土壤总DNA提取及amoA基因丰度测定

4．2．7 数据分析

4．3 结果与分析

4．3．1 试验地全年气温变化

4．3．2 长期施肥处理土壤基本理化性质

4．3．3 添加C8H14微域培养过程中OM土壤无机氮含量变化

4．3．4 添加C8H14培养前后OM土壤AOA和AOB amoA基因丰度变化

4．3．5 不同培养温度下土壤无机氮含量变化

4．3．6 不同培养温度下土壤AOA和AOB amoA基因丰度变化

4．4 讨论

4．4．1 温度对酸性旱地土壤硝化活性的影响

4．4．2 温度对酸性旱地土壤硝化微生物的影响

4．5 结论

第5章 长期施肥酸性旱地土壤微生物群落与功能的变化特征

5．1 前言

5．2 材料与方法

5．2．1 土样处理与理化性质测定

5．2．2 土壤总DNA提取及MiSeq高通量测序分析

5．2．3 数据分析

5．3 结果与分析

5．3．1 长期施肥处理土壤细菌群落丰度变化

5．3．2 长期施肥处理土壤细菌群落组成变化

5．3．3 长期施肥处理土壤细菌群落多样性

5．3．4 环境因子对细菌群落多样性的相对贡献

5．3．5 土壤细菌代谢途径和功能基因变化

5．4 讨论

5．4．1 长期施肥对酸性旱地土壤细菌群落组成及多样性的影响

5．4．2 长期施肥对酸性旱地土壤原核微生物群落组成的影响

5．5 结论

第6章 总结与展望

6．1 总结

6．2 研究特色与创新性

6．3 不足与展望

参考文献

附录

致谢