睾丸酮、孕酮以及氟他胺对萼花臂尾轮虫雄体的行为、受精率与寿命影响

摘要

本文采用国际上通用的萼花臂尾轮虫（Brachionus calyciflorus）雄体作为研究对象，研究了睾丸酮、氟他胺和孕酮对雄体萼花臂尾轮虫的行为学（游泳行为、交配行为）、受精率、寿命以及体型的影响。分析了雄体运动能力与生殖能力的关系，并研究了睾丸酮、氟他胺和孕酮分别两两联合作用对雄体萼花臂尾轮虫游泳行为和受精率的影响。为雄体轮虫作为雄性无脊椎动物生殖毒理学受试动物提供了一定的参考。主要研究结果如下:
　　1、萼花臂尾轮虫有性生殖诱导研究。
　　在25℃实验室培养下，将萼花臂尾轮虫孤雌生殖群体通过300目细胞筛富集，用双蒸水冲洗数次，去除培养过程中产生的原生动物与微小杂质，得到高密度轮虫群体，投喂密度为1×106cells/mL的小球藻（Chlorella pyrenoidosa），研究其不同初始种群密度对有性生殖的诱导效果。结果显示:50、100、500、1000ind/mL组4日内种群密度稳定，无显著差异，2000ind/mL组在第2d种群密度显著下降。500、1000、2000ind/mL组在第2d以后均有大量雄体出现并产生休眠卵。从维护种群稳定的方面看，当初始种群密度达到500ind/mL时，轮虫有性生殖诱导效果最佳。
　　2、环境激素对雄体萼花臂尾轮虫游泳行为影响
　　从有性诱导后的轮虫群体中，挑取出生4h内游泳迅速的雄性个体利用奥林巴斯BX41显微镜、DP70image capture system和Cellsens Standard软件拍摄和捕捉轮虫的运动状态，分别暴露在睾丸酮(0.5-6.0mg/L)、氟他胺（0.5-6.0mg/L）和孕酮(0.5-6.0mg/L)中处理2h后，再次拍摄记录轮虫的运动状态。结果显示:睾丸酮、氟他胺、孕酮对雄体游泳曲折率均无显著影响（P＞0.05）。暴露睾丸酮处理下，雄体的游泳速率受到显著提高，相对应的游泳速率变化率回归方程为Y=-3.9597X2+28.4066X-6.5309，R2=0.89P=0.02＜0.05;暴露在孕酮处理下，雄体的游泳速率受到显著抑制，相对应的游泳速率变化率回归方程为Y=-0.1692X2-7.7092X+0.4543，R2=0.98P=0.00＜0.01;暴露在氟他胺处理下，雄体的游泳速率受到显著抑制，相对应的游泳速率变化率回归方程为:Y=-0.1667X2-8.9862X+1.3892，R2=0.99P=0.00＜0.01。结果表明萼花臂尾轮虫雄体游泳速率指标对环境激素较为敏感。
　　从有性诱导后的轮虫群体中，挑取出生4h内新出生雌雄个体，以10∶3的雌雄比分别暴露在三种激素下进行交配行为观察实验。与对照组相比，睾丸酮暴露处理时，在1、2和3h以内，对雄体交配识别能力均有显著提高（P＜0.05），随着暴露时间延长，暴露4、5、6h时，各组雄体识别能力均有下降，对照组也表现出同样特征;孕酮暴露处理6h的结果显示，雄体交配识别能力均显著被抑制，暴露6h时，各浓度组交配识别率均达到最低水平，氟他胺的结果与孕酮相似。结果表明，萼花臂尾轮虫雄体交配识别率指标对环境激素敏感，但与雄体寿命和个体差异的关系也较大。
　　3、环境激素对萼花臂尾轮虫雄性个体生殖力影响
　　雄轮虫暴露在睾丸酮(0.5-6.0mg/L)、氟他胺(0.5-6.0mg/L)和孕酮(0.5-6.0mg/L)中，处理24h的受精率的实验表明:结果环境雄激素睾丸酮暴露处理后，能显著提高雄体的受精能力(P＜0.05)，2mg/L处理组达到最高，受精成功率为48.61±3.18％;环境雌激素孕酮和雄激素拮抗剂氟他胺各浓度组暴露处理后，雄体受精成功率均受到显著抑制（P＜0.05），且随着药物浓度的上升，抑制作用越强。
　　单个体寿命实验中，雄激素睾丸酮(0.5-6.0mg/L)显著缩短轮虫雄体个体寿命（P＜0.05），但随着睾丸酮的浓度上升，缩短幅度变化不显著，这可能是因为睾丸酮是雄性激素，它能促进雄体的游泳速率，同时消耗了更多的能量，由于雄体不具有消耗系统，全部能量只来自于胚胎，这种能量分配必然会导致雄轮虫寿命的缩短。反观雌激素孕酮和雄激素拮抗剂氟他胺对轮虫雄体的寿命影响并不显著（P＞0.05）。
　　通过结合不同激素在不同浓度下对游泳速率和雄体受精能力影响的综合分析，得到雄体游泳速率与雄体受精成功率指标关系曲线，回归方程为:Y=42.17/(1+(9.51-X)00525)+4.29，R2=0.9456P=1.82×10-11＜＜0.01。利用此回归方程可较好的阐述雄体运动能力与生殖能力之间的关系。
　　4、激素联合作用对雄体萼花臂尾轮虫雄体行为以及生殖能力的影响
　　激素组合实验结果显示:环境雄激素睾丸酮与其拮抗剂氟他胺组合处理组合处理、雄激素睾丸酮和雌激素孕酮组合处理对轮虫雄体受精成功率，表现为拮抗效应，但组合效应在雄轮虫游泳行为上无显著差异。氟他胺和孕酮在受精率和游泳行为上无交互作用。孕酮和氟他胺均为1mg/L时抑制作用最强，游泳速率变化率为-10.5％，受精率为3.1％。

目录

声明

摘要

第一章 综述

1．1 轮虫在毒理学研究中的作用

1．2 轮虫的生活史和雄性轮虫的研究

1．2．1 单巢钢轮虫的主要特征

1．2．2 轮虫的生活史

1．2．3 轮虫的两性异形

1．2．4 两性异形在进化中的作用

1．2．5 雄体轮虫的研究意义

1．2．6 轮虫生态毒理学中的有性生殖指标

1．3 有性生殖产生机制的研究

1．3．1 有性生殖发生理论假说

1．3．2 有性生殖的影响因子

1．4 环境激素对轮虫种群的影响

1．4．1 环境激素的定义与来源

1．4．2 环境激素的特性和生物学效应

1．4．3 环境激素的危害

1．4．4 环境激素对水生生物的影响

1．4．5 氟他胺、睾丸酮、孕酮简述

1．5．技术路线

第二章 萼花臂尾雄体有性生殖诱导的研究

2．1 前言

2．2 材料与方法

2．2．1 实验材料的培养

2．2．2 培养基

2．2．3 不同种群密度下的群体培养实验

2．2．4 分析方法

2．3 结果

2．3．1 不同初始种群密度4天内种群变化情况

2．3．2 不同初始种群密度4天内雄体数量的变化

2．3．3 不同初始种群密度4天内休眠卵的产量

2．4 讨论

第三章 环境激素对雄体轮虫的行为影响

第一节 睾丸酮、孕酮和氟他胺对萼花臂尾轮虫雄体游泳行为影响

3．1．1 前言

3．1．2 材料与方法

3．1．3 结果

3．1．4 讨论

第二节 睾丸酮、孕酮和氟他胺对萼花臂尾轮虫雄体交配行为影响

3．2．1 前言

3．2．2 材料与方法

3．2．3 结果

3．2．4 讨论

第四章 环境激素对雄体轮虫生殖能力影响

第一节 睾丸酮、孕酮和氟他胺对萼花臂尾轮虫受精率影响

4．1．1 前言

4．1．2 材料与方法

4．1．3 结果

4．1．4 讨论

第二节 睾丸酮、孕酮和氟他胺对萼花臂尾轮虫雄体体型与寿命影响

4．2．1 前言

4．2．2 材料与方法

4．2．3 结果

4．2．4 讨论

第五章 激素联合作用对萼花臂尾轮虫雄体游泳速率和受精率影响

5．1 前言

5．2 材料与方法

5．2．1 轮虫培养与有性生殖诱导

5．2．2 药品配置

5．2．3 游泳行为与雄体交配率实验

5．2．4 相关参数和数据分析

5．3 结果与分析

5．3．1 激素联合对萼花臂尾轮虫雄体游泳速率变化率的影响

5．3．2 激素联合对萼花臂尾轮虫雄体受精率的影响

5．4 讨论

第六章 全文总结

参考文献

在读期间发表的学术论文及科研成果

致谢