构巢曲霉β-1，3-葡聚糖酶ENGA的异源重组表达、鉴定及生理功能研究

摘要

真菌细胞壁是位于真菌原生质体外的一种刚性结构，在真菌的生理活动中起到重要的作用。真菌细胞壁中含有大量的葡聚糖和几丁质，构成细胞壁的骨架。在真菌部分生理活动中，如丝状真菌菌丝分支或酵母的出芽和分裂过程中，内切β-1，3-葡聚糖酶可能通过水解作用维持细胞壁的可塑性。此外，真菌内切β-1，3-葡聚糖酶还参与胞外营养物质的利用及细胞壁的自溶过程。
　　本课题组前期研究发现，灰盖鬼伞的葡聚糖内切酶ENG1参与细胞壁的重构，本研究以子囊属真菌构巢曲霉为研究材料，在数据库中查到构巢曲霉GH16家族共有10个基因。本研究希望利用重组表达研究上述葡聚糖内切酶的酶学性质，最终成功的重组表达一个具有水解活性的β-1，3-葡聚糖酶蛋白(AN0245)，并对它的酶学性质及生理功能展开了研究。
　　本研究以甲醇诱导型的毕赤酵母为宿主细胞，对构巢曲霉GH16中的内切-β-1，3(4)-葡聚糖酶ENGA进行异源重组表达。重组表达菌株在30℃培养条件下以每24 h添加终浓度为0.5％的甲醇进行诱导表达，可在胞外表达出有活性的蛋白，将粗酶液用Ni-柱纯化后获得大量含高活性的ENGA蛋白，SDS-PAGE显示ENGA的分子量大小为37 KDa。对该酶的酶学性质研究发现，其最适反应温度为60℃和最适pH为pH5.5，具有较宽的温度稳定性(20-70℃)和pH稳定性(4.0-9.0)，HPAEC分析显示ENGA具有β-1，3-葡聚糖内切水解酶活性和转糖基活性，在以昆布多糖为底物时，动力学参数Km和Vmax分别为30 mg/mL，384.6μmol/mg·min。
　　定量PCR分析显示，在碳饥饿和β-1，3葡聚糖作为唯一碳源的情况下，ENGA表达量较高，表明其可能参与细胞壁的自溶及胞外营养物质利用过程。本研究对构巢曲霉的ENGA进行了基因敲除，但结果显示敲除菌株与野生菌株的表型在各种条件下并没有明显差异，其原因可能是ENGA的同源基因在敲除菌株中高表达互补其功能。

目录

声明

摘要

第1章 绪论

1．1 真菌细胞壁的组成成分

1．2 真菌细胞壁的结构

1．3 真菌细胞壁的重构作用

2 真菌细胞壁中的葡聚糖酶

2．1 真菌中β-葡聚糖酶的分类及作用

2．2 真菌中β-1，3-葡聚糖酶的研究进展

3 本论文的研究内容及意义

第2章 构巢曲霉ENGA的重组表达和酶学性质的研究

第一节 构巢曲霉ENGA的真核重组表达

1 engA基因重组表达载体的构建

2 ENGA在毕赤酵母中的重组表达

3 ENGA的分离纯化

第二节 构巢曲霉ENGA的酶学性质研究

1．材料与方法

2 结果

第三节 讨论

第3章 ENGA的敲除及其生理功能的研究

1 材料与方法

2 结果

第二节 敲除菌株的构建

1 材料与方法

2 结果

第三节 △engA菌株的表型测试及与细胞壁自溶的关系

1 材料与方法

2 结果

第四节 讨论

第4章 全文总结

参考文献

在读期间发表的学术论文及研究成果

致谢