生半夏胚胎发育毒性及其复方配伍减毒作用的蛋白质组学分析

摘要

中药半夏Pinellia ternata(Thunb.)Breit具有降逆止呕的功效，其复方“干姜人参半夏丸”是《金匮要略》中的经典名方，临床上常用于治疗妊娠呕吐。虽自古认为半夏生用有毒，但生半夏及其配伍后复方是否有胚胎发育毒性尚不明确。为此，我们开展了如下三部分实验:
　　首先，我们采用亚急性毒性试验和致畸敏感期毒性试验考察了生半夏粉的胚胎发育毒性以及干姜人参半夏粉的配伍减毒效应。研究结果发现，生半夏粉(2.275g/kg/d)连续给药14d，与正常对照组相比，未孕小鼠体重显著下降，肾脏病变明显，血液和脾脏的T淋巴细胞亚群比例变化显著(P＜0.05);致畸敏感期(妊娠第6.5-15.5d)给药10d后导致孕鼠心、肾组织病变明显，妊娠第18.5d体重及宫外增重显著低于对照组(P＜0.05);胎仔身长显著降低（P＜0.05）。而对应剂量的干姜人参半夏粉组与正常对照组在各项指标上无显著差异（P＞0.05）。研究结果提示，生半夏粉有明显的母体和胚胎毒性，干姜、人参配伍对生半夏有解毒效应。
　　在此基础上，我们进一步采用基于iTRAQ的定量蛋白质组学技术探讨了生半夏的胚胎发育毒性机制。妊娠第6.5-8.5d灌胃给予小鼠生半夏粉，第9d采集药物干预组及正常对照组的小鼠原肠胚，运用基于iTRAQ的蛋白质组学技术鉴定分析两组差异显著蛋白(DAPs)，采用多组学数据分析工具OmicsBean(http://www.omicsbean.cn)对153个DAPs进行生物信息学分析，实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法验证了部分DAPs的表达水平。结果显示47.4％的DAPs与神经系统发育相关，显著富集于黑质发育过程及多条退行性疾病通路。研究结果提示生半夏粉引起神经系统发育相关蛋白（如TWSG1，BASP1）的表达异常可能是其导致小鼠胚胎发育毒性的潜在机制。
　　最后，我们又采用非标记定量（Label-free）的蛋白质组学技术比较了生半夏粉以及干姜人参半夏粉干预前后小鼠原肠胚的差异蛋白质组，以及相应的含药血清干预前后小鼠胚胎干细胞(mESC)的差异蛋白质组。结果在胚胎组织及mESC中分别鉴定到163和197个DAPs，体内外差异蛋白质组的生物信息学分析结果比较一致。干姜人参半夏粉干预后，DAPs在神经系统发育过程中所占比例显著减少，而散在分布于呼吸、心室、神经、骨、内皮和眼等多个系统的发育过程，并显著富集于Wnt、Hippo发育相关信号通路。研究结果提示干姜人参半夏复方可能通过调控发育Wnt、Hippo相关信号通路蛋白的表达水平，缓减生半夏粉引起的神经发育毒性，从而起到配伍减毒的功效。
　　综上所述，本论文确认了生半夏的胚胎发育毒性和干姜人参半夏复方的配伍减毒效应;通过蛋白质组学技术研究，首次发现生半夏的潜在胚胎毒性机制可能在于其引起了小鼠神经系统发育过程中相关蛋白的表达水平异常;干姜、人参与生半夏配伍后可能通过调控Wnt、Hippo发育相关信号通路蛋白的表达发挥配伍减毒的功效。研究结果可为临床合理应用半夏及其复方提供理论依据，同时促进中医药的现代化研究及国际化交流。

目录

声明

摘要

第1章绪论

1．1半夏毒性及其复方配伍减毒研究进展

1．2中药的胚胎发育毒性研究进展

1．3比较蛋白质组学在中药药理及毒理研究中的应用

1．4本课题研究思路

第2章生半夏粉及干姜人参半夏粉干预后对小鼠一般毒性及胚胎发育的影响

2．1前言

2．2材料

2．2．1主要药品与试剂

2．2．2动物

2．2．3中药药材及制备

2．3方法

2．3．1亚急性毒性实验

2．3．2致畸敏感期毒性实验

2．3．3组织病理学检测

2．3．4流式细胞术检测

2．3．5数据统计

2．4结果

2．4．1短期重复给药14d对未孕小鼠的影响

2．4．2致畸敏感期给药10d对孕鼠及胚胎发育的影响

2．5分析与讨论

第3章基于iTRAQ标记的蛋白质组学方法燃半夏粉干预后小鼠胚胎蛋白质表达差异

3．1前言

3．2材料

3．3方法

3．3．1动物分组给药及样本收集

3．3．2蛋白提取及酶解

3．3．3 iTRAQ标记和RP预分级(reversed-phase fractionation)

3．3．4 LC-MS／MS分析

3．3．5数据库搜索及定量分析

3．3．6生物信息学分析

3．3．8 Western blot验证差异蛋白

3．3．9数据统计

3．4结果

3．4．3差异蛋白质组的功能注释和分类

3．4．4 qRT-PCR验证结果

3．4．5 Western blot验证结果

3．5分析与讨论

第4章非标记定量蛋白质组学方法分析生半夏粉及复方粉干预后小鼠胚胎或mESO细胞的蛋白表达差异

4．1前言

4．2材料

4．3方法

4．3．1动物分组给药及样本收集

4．3．2mESC的分化培养

4．3．3细胞分组给药及样本收集

4．3．4蛋白提取及酶解

4．3．5 LC-MS／MS分析

4．3．6数据库搜索及定量分析

4．3．7生物信息学分析

4．4结果

4．4．1基于Label-free的胚胎蛋白质组定量与分析

4．4．2基于Lsbel-free的mESC细胞蛋白质组定量与分析

4．5分析与讨论

第5章全文总结

附录

参考文献

在读期间发表的学术论文及研究成果

致谢