Latrophilin通过调控CSP7,OBPC01,CYP4BN1和CYP6BQ11参与赤拟谷盗的杀虫剂抵抗性

摘要

Latrophilin(LPH)属于G蛋白偶联受体(GPCR)家族中一个独特的分支，并且被称之为粘附性的GPCR，其首次鉴定作为黑寡妇蜘蛛毒液中有效成分神经毒素(α-latrotoxin，α-LTX)的潜在靶标。作为一种经典的GPCR，LPH在不同生物（人、小鼠和果蝇）体内参与调控多动症、躁郁症以及精神分裂症等多种精神疾病的发生。我们实验室最近研究显示在赤拟谷盗中通过RNAi技术对Tclph基因进行干扰不仅导致了部分幼虫形态缺陷，并且伴随生殖能力显著降低，这与其他小组的研究结果相一致。有趣地是，我们还首次发现在赤拟谷盗幼虫阶段敲减Tclph增加了其对抗胆碱杀虫剂（敌敌畏和克百威）的敏感性，暗示Tclph参与了杀虫剂的抵抗过程。然而，关于Tclph的下游分子调节机制目前还不清楚。因此，我们进一步利用转录组测序(RNA-seq)技术筛选Tclph下游抗性相关基因以阐明其信号转导通路，并且在赤拟谷盗体内对这些相关基因进行了功能分析并得到了以下结果。
　　首先，RNA-seq结果显示在赤拟谷盗中干扰Tclph分别导致了两个杀虫剂转运相关基因（TcCSP7、TcOBPC01）以及两个杀虫剂代谢相关基因（TcCYP4BN1、TcCYP6BQ11）的差异表达，并且这个结果已使用荧光定量PCR实验(qRT-PCR)得到了验证，暗示Tclph可能通过调控这四个基因的表达参与赤拟谷盗的某种生理功能。随后，对干扰Tclph基因的幼虫分别采用两种不同杀虫剂敌敌畏和克百威进行刺激，我们发现在处理过后的12-72小时内Tclph基因表达显然被抑制，并且导致TcCSP7、TcCYP4BN1和TcCYP6BQ11基因表达显著下降，而TcOBPC01基因表达则被显著上调。这个结果进一步揭示了Tclph在转录水平上可能通过直接调控TcCSP7、TcCYP4BN1和TcCYP6Q11基因的表达参与杀虫剂抗性，而过度表达的TcOBPC01则可能是当赤拟谷盗幼虫体内缺乏Tclph时对其杀虫剂抗性进行补偿。
　　此外，我们对TcCSP7、TcOBPC01、TcCYP4BN1和TcCYP6BQ11基因在赤拟谷盗生长发育、杀虫剂抗性过程的影响进行了功能分析。时空表达模式显示这四个基因在不同发育时期和组织中均有所表达，但各自又有其特点:TcCSP7在早期蛹阶段以及在头部和触角组织表达量较高;TcOBPC01主要在晚期幼虫以及在头部、脂肪体和触角高表达;TcCYP4BN1在早期蛹阶段以及在头部和马氏管组织表达量较高;而TcCYP6BQ11主要在蛹期（早期蛹、晚期蛹）以及在肠和马氏管高表达。另外，将赤拟谷盗幼虫暴露在敌敌畏和克百威之下，发现与丙酮对照组相比，TcCSP7、TcOBPC01、TcCYP4BN1和TcCYP6BQ11基因都能不同程度地被诱导表达，暗示这四个基因可能参与杀虫剂抗性。因此，我们对这四个基因进行了RNAi分析，干扰TcCSP7、TcOBPC01、TcCYP4BN1和TcCYP6BQ11特定地抑制了相应的基因表达，尤其是在第五天抑制效率达到最大。有趣地是，在赤拟谷盗体内干扰这四个基因并不影响其存活，暗示对其生长发育没有任何影响。接下来，在幼虫阶段干扰TcCSP7、TcOBPC01、TcCYP4BN1和TcCYP6BQ11基因后的第五天，分别采用敌敌畏和克百威进行处理，我们发现与对照组相比，干扰组死亡率明显增加，进一步证实了这四个基因的确参与杀虫剂抗性。这些结果为阐明Tclph基因通过平衡调控杀虫剂转运基因以及杀虫剂代谢解毒基因的表达参与杀虫剂抗性提供了必要的证据。

目录

声明

摘要

英文缩写词简表

第1章绪论

1．1蛛毒素受体Latrophilin研究现状

1．1．1 Latrophilin的鉴定、分类以及结构分析

1．1．2 Latrophilin的功能研究

1．2昆虫杀虫剂抗性代谢的研究进展

1．2．1杀虫剂抗药性及其抗性机制的研究

1．2．2昆虫OBPs和CSPs的研究进展

1．2．3昆虫CYP450s的研究进展

1．3模式昆虫-赤拟谷盗简介

1．4本研究的目的及意义

第2章赤拟谷盗Latrophilin下游抗性基因的筛选及其调控关系

2．1引言

2．2实验仪器、材料和试剂

2．2．1实验仪器

2．2．2实验材料

2．2．3实验药品与试剂

2．3实验方法

2．3．1缓冲液的配制

2．3．2 Tclph的双链RNA(double-strand RNA，dsRNA)的合成

2．3．3 Tclph的dsRNA的注射

2．3．4总RNA抽提

2．3．5 cDNA的合成

2．3．6 qRT-PCR检测基因表达水平

2．3．7杀虫剂处理实验

2．3．8数据处理

2．4结果

2．4．1干扰Tclph影响杀虫剂转运以及杀虫剂代谢相关基因的表达

2．4．2 Tclph通过平衡调控TcCSP7和TcOBPC01的表达参与杀虫剂抗性

2．4．3 Tclph通过调控TcCYP4BN1和TcCYP6BQ11的表达参与杀虫剂抗性

2．5讨论

第3章赤拟谷盗Latrophilin下游抗性基因的功能分析

3．1引言

3．2实验材料、仪置及试剂

3．2．1实验材料

3．2．2实验仪器

3．2．3实验药品与试剂

3．3实验方法

3．3．1总RNA抽提

3．3．2 cDNA的合成

3．3．3各个基因不同发育时期、组织表达模式分析

3．3．4杀虫剂诱导分析

3．3．5 RNAi分析

3．3．6杀虫剂敏感性检测

3．3．7数据处理

3．4结果

3．4．1 TcCSP7、TcOBPC01、TcCYP4BN1和TcCYP6BQ11的时期表达模式分析

3．4．2 TcCSP7、TcOBPC01、TcCYP4BN1和TcCYP6BQ11的组织表达模式分析

3．4．3杀虫剂对TcCSP7、TcOBPC01、TcCYP4BN1和TcCYP6BQ11的诱导模式分析

3．4．4干扰TcCSP7、TcOBPC01、TcCYP4BN1和TcCYP6BQ11干扰效率最大时间点的探索

3．4．5干扰TcCSP7、TcOBPC01、TcCYP4BN1和TcCYP6BQ11表达对杀虫剂抗性的影响

3．5讨论

第4章结论

参考文献

在读期间发表的学术论文及研究成果

致谢