CyHV-2引起的异育银鲫鳃出血病组织病理及致病机理研究

摘要

鲫鱼是我国最为常见的淡水养殖鱼类，广泛分布于全国各地，是我国大宗淡水鱼类养殖结构的重要组成品种。2012年，全国鲫鱼养殖产量近245万吨，居我国淡水鱼品种第五位，异育银鲫(C.auratus gibelio♀×Cyprinus carpio var.singuonensis♂)是近二十年来鲫鱼养殖推广最为广泛的品种，但自2012年以来，异育银鲫发生了一种严重的新型病害——鳃出血病，在主要养殖区广泛传播，给养殖生产造成巨大的经济损失。
　　鳃出血病不同于鲫鱼的常规病害，它具有低水温发病、传染性强、发病迅速、致死率高、难以预防和控制等特征，更重要的是国内以前未有发病报道，发病原因不明，流行规律也不清楚，这严重威胁了异育银鲫养殖业发展。因此，迫切需要开展新型疫病的流行病学调查，查明发病规律;开展病原鉴定，查明病因;建立有效检测方法;同时阐明其致病机理，为下一步进行异育银鲫鲤出血病的防治奠定了基础。
　　1.开展流行病学调查
　　根据《江苏省水产养殖病害测报规范》，开展流行病学调查，得出鳃出血病的基本流行规律:(1)多发于春季和秋季，水温15～25℃是发病高峰期;(2)患病鱼鳃部出血明显，病鱼尾鳍、背鳍末端色素减退、明显发白，病鱼鳔上有明显出血性瘀斑;(3)具有明显传染性，主要危害一龄幼鱼与二龄成鱼;(4)病原具有较强的宿主专一性，不感染同一养殖环境内的其它淡水鱼类;(5)集中投喂方式引起更高的传染率。
　　2.异育银鲫鳃出血病的组织与超微病理学研究及病原鉴定
　　组织病理结果显示:病鱼鳃瓣处出现血细胞浸润，鳃小片融合，伴有上皮细胞坏死和脱落;鳃瓣内成团的吞噬细胞带有大小不一的胞浆空泡，显示具有弱嗜碱性;病鱼肾脏肾小球有局灶性坏死病变，毛细血管壁扩张;肾小球肥大细胞核固缩、碎裂，严重空泡化。患病鱼脾脏内血细胞和淋巴样细胞浸润，出现严重空泡化。许多脾脏细胞核染色质边缘化，有些出现核碎裂。患病鱼肝细胞核增大，有核内包涵体，细胞核肥大伴有核固缩，同时有严重的空泡化;肝内胆管显示有炎症，管壁细胞肿胀彼此融合，导致管壁粗糙和异常。患病鱼肠上皮细胞脱落，肠粘膜受损，结缔组织有增生。对病鱼的相应组织进行病理半定量评估，病理变化最显著的是肾脏，其次是鳃、脾脏和肝脏。超微病理观察发现，病鱼鳃、脾脏、肾脏有病毒感染，在细胞质内具包膜病毒粒子170-200nm。病毒在细胞质内有进行成熟加工过程，病毒粒子穿越高尔基网进入带有糖蛋白的囊泡，在囊泡内形成包膜病毒，通过细胞质衣壳的二次包裹，最终在细胞质中形成成熟病毒粒子。
　　利用鲤科疱疹病毒聚合酶基因的特异性引物从病鱼鳃、肾脏和脾脏组织中PCR扩增出362bp的目的条带，测序后序列比对结果显示与金鱼造血器官坏死疱疹病毒(CyHV-2)具有99％相似性，病毒分子鉴定的结果为鲤科疱疹病毒Ⅱ型。
　　利用柯赫氏法则开展病原验证，健康鱼人工回感后第3日开始出现死亡，濒死鱼具备自然发病鱼的鳃出血、尾鳍背鳍末端发白、鱼鳔上具出血性瘀斑等典型临床症状，至第5日，回感组鱼全部死亡。分子检测回感死鱼的鳃、肾、脾、肝等组织均为CyHV-2阳性，电镜检查肾、脾组织也观察到CyHV-2病毒颗粒，进而确证鲤科疱疹病毒Ⅱ型为异育银鲫鳃出血病的病原，与此前及此后相关报道一致。
　　3.CyHV-2荧光原位杂交(Fluorescence In Situ Hybridization，FISH)检测方法的建立
　　通过探针合成、荧光标记、原位杂交等过程，建立CyHV-2荧光原位杂交检测方法，结果表明:探针不与健康鱼组织结合，证明其具有特异性。在肾脏、脾脏、肝脏和鳃局部坏死病灶出现的荧光强度最大，这与HE染色的组织病理学分析结果一致。对于CyHV-2检测，荧光强度最大是在43℃。另外探针浓度在5ng/μL时即可以获得特异和足够的荧光，探针浓度过高(50ng/μL)导致荧光强度升高，但特异性降低。
　　4.基于转录组和蛋白组学研究CyHV-2的致病机理
　　为了进一步探究CyHV-2侵染异育银鲫的分子致病机制以及宿主相应的免疫机理，本章通过转录组测序和TMT(Tandem Mass Tag)标记定量蛋白质组学技术，筛选CyHV-2感染异育银鲫3天后出现典型症状时，头肾中具有差异表达的基因和蛋白，结果表明:通过转录组序列分析发现异育银鲫感染CyHV-2后，其头肾中有3090个显著上调基因，有3995个显著下调基因;而通过TMT蛋白组定量技术筛选得到197个蛋白表达显著上调，53个蛋白表达显著下调;转录组与蛋白质组联合分析结果表明，转录和蛋白表达都上调的有86个，转录和蛋白表达都下调的有42个。KEGG信号通路发现上调蛋白或基因主要富集在单纯疱疹病毒感染信号通路、RIG-I样信号通路、坏死性凋亡等免疫相关信号通路中。QPCR结果进一步显示这三条信号通路中的LGP2、RIG-I、MDA5、FAS、PKZ、PKR基因的转录水平在感染CyHV-2后的典型发病期显著上调，这与转录组和蛋白组的变化趋势一致。
　　5.基于代谢组学研究CyHV-2对异育银鲫代谢的影响
　　为了进一步探究CyHV-2侵染对异育银鲫代谢的影响，本章使用了基于LC-Q/TOF-MS分析平台的非靶向代谢组学方法，对异育银鲫感染CyHV-2的血清代谢组的变化进行了调查研究。通过代谢组数据一共鉴定到79种差异代谢物，其中几种碳水化合物（葡萄糖、甘露糖、核糖等）、脂肪酸（十五酸、花生四烯酸、棕榈酸、二十碳五烯酸、羟基二十碳四烯酸、亚油酸及其衍生物）、大部分的氨基酸及其衍生物浓度显著升高。同时鸟嘌呤、胞嘧啶、尿苷、VB2等物质显著下调。代谢通路分析结果显示患病鱼糖和氨基酸转运能力、tRNA及氨基酸合成能力增强。

目录

声明

摘要

第1章文献综述

1．1我国鲫鱼生物学分类、地理种群、养殖品种与养殖概况

1．1．1我国鲫鱼生物学分类

1．1．2我国鲫鱼地理种群

1．1．3养殖品种与养殖概况

1．1．4小结

1．2鲫鱼病毒性病害种类及研究进展

1．2．1鲫鱼病毒性病害种类

1．2．2鲫鱼病毒性病害研究进展

1．2．3小结

1．3异育银鲫鳃出血病的发现

1．4本论文的研究目的、意义、内容和技术路线

1．4．1本论文研究目的和意义

1．4．2本论文研究内容

1．4．3本论文技术路线

第2章鳃出血病流行病学调查

2．1调查方法

2．2调查用仪器设备

2．3结果

2．3．1发病历史

2．3．2发病季节

2．3．3发病症状

2．3．4主要危害对象

2．3．5苗种来源及养殖管理(苗种来源、养殖模式、养殖水质状况、饲料种类)

2．4分析与讨论

第3章鳃出血病的病理学研究及病原鉴定

3．1材料

3．1．1主要仪器设备

3．1．2主要试剂

3．1．3样品采集

3．2方法

3．2．1光镜样品的制作与处理

3．2．2电子显微镜样品制作与处理

3．2．3 PCR扩增与序列测定

3．2．4柯赫氏法验证的回归感染实验

3．3结果

3．3．1组织病理观察

3．3．2病理损伤评价

3．3．3超微病理观察

3．3．4 PCR扩增与序列测定

3．3．5回归感染试验

3．3．6回归感染试验后的超微病理学验证

3．4讨论

第4章CyHV-2荧光原位杂交检测方法的建立

4．1主要试剂与仪器

4．2实验方法

4．2．1 CyHV-2的PCR检测

4．2．2样品固定及切片制备

4．2．3探针合成与标记

4．2．4原位杂交

4．3结果

4．4讨论

第5章基于转录组和蛋白组学研究CyHV-2的致病机理

5．1实验材料

5．1．1实验动物和病毒

5．1．2主要器材及设备

5．1．3主要试剂

5．2实验方法

5．2．1 CyHV-2感染异育银鲫及头肾组织的取样

5．2．2异育银鲫头肾总RNA的提取及浓度测定

5．2．3 Oligo dT富集异育银鲫头肾mRNA、片段化mRNA、反转录合成cDNA、连接adaptor

5．2．4异育银鲫头肾转录组Illumina Hiseq上机测序、数据质量剪切及统计

5．2．5异育银鲫头肾转录组从头组装及注释

5．2．6异育银鲫头肾转录组基因表达差异分析

5．2．7异育银鲫头肾总蛋白的提取、浓度测定及胰酶酶解

5．2．8异育银鲫头肾总蛋白TMT标记、HPLC分级、．液相色瞥质谱联用分析

5．2．9异育银鲫头肾总蛋白数据库搜索

5．2．10异育银鲫头肾总蛋白生物信息学分析

5．2．11实时荧光定量PCR检测差异表达蛋白基因水平表达变化

5．3实验结果

5．3．1异育银鲫头肾转录组测序试验结果与分析

5．3．2异育银鲫头肾蛋白质组结果与分析

5．3．3异育银鲫头肾转录组与蛋白质组联合分析

5．2．4异育银鲫头肾转录组Illumina Hiseq上机测序、数据质量剪切及统计

5．4讨论

第6章基于代谢组学研究CyHV-2对异育银鲫代谢的影响

6．1实验材料

6．1．1主要器材及设备

6．1．2主要试剂

6．2实验方法

6．2．1 CyHV-2感染异育银鲫血清取样

6．2．2异育银鲫血清代谢组样品处理方法

6．2．3色谱-质谱分析

6．2．4数据处理

6．2．5差异代谢物的筛选

6．2．6差异代谢物的生物信息学分析

6．3实验结果

6．3．1异育银鲫血清代谢组质量控制

6．3．2异育银鲫血清代谢组数据分析

6．3．3感染CyHV-2过程中异育银鲫血清代谢

6．3．4差异代谢物生物信息学分析

6．4讨论

全文小结

参考文献

在读期间发表的学术论文及研究成果

致谢