多枝赖草（Leymus multicaulis）盐胁迫应答相关基因的克隆及表达分析

摘要

多枝赖草(Leymusmulticaulis〈Kar1&Kir1〉Tzvel1，2n=4X=28，XmXmNsNs)属于小麦近缘属赖草属，分布于欧亚地区不同的生态环境下，我国主要分布于新疆地区，生长于平原绿洲和盐渍化荒漠草甸，具有突出的耐瘠薄、耐盐碱性、耐寒性等特性。开展多枝赖草抗逆分子生物学研究，分离耐盐相关基因，对于农作物的耐盐育种具有重要意义。本研究以盐胁迫下的多枝赖草叶片为材料，改良了多枝赖草叶片总RNA提取方法，建立了适合多枝赖草的mRNA差异显示体系，分离与分析耐盐相关基因eDNA序列，克隆谷胱甘肽还原酶基因。结果如下： 采用四种方法提取多枝赖草叶片总RNA(异硫氰酸胍法、SDS法、CTAB法和TRIZOL试剂快速提取法)，结果表明：TRIZOL提取法提取的RNA产量较低，电泳呈现出28SrRNA、18SrRNA和5SrRNA三条清晰的条带，A260/A280为1.845，A260/A230为2.091，表明RNA的纯度很高。而另外三种方法获得的RNA纯度低，有降解现象。用TRIZOL法提取的RNA作为模板，可以扩增出组成型Actin基因片段，表明提取的多枝赖草叶片总RNA能够满足分子生物学研究需要。 通过对退火温度、模板用量、Taq酶和Mg2+浓度的优化，建立了适合多枝赖草基因差异显示的DDRT-PCR体系。选用26个随机引物，分别与3个锚定引物组合成引物对，进行盐胁迫下多枝赖草mRNA差异显示，获得17个长度在300～600bp的差异cDNA条带，进行序列测定及分析。反Northern杂交分析筛选出11个阳性片段。 GenBank/BLAST分析，DNA片段1编码的蛋白与腺苷酸结合蛋白有29％的相似，这与DNA的表达调节有关；cDNA片段2编码的蛋白质与与UMP/CMPkinase42％相似，UMP/CMPkinase与核苷酸的磷酸化有关，在信号传导方面起作用；cDNA片段4编码的蛋白质与S9蛋白有49％的相似性，S9蛋白具有清除活性氧的功能，而活性氧是各种水分胁迫的主要伤害方式；可能与植物的活性氧清除有关；该片段与GenBank中干旱胁迫二色高粱cDNA文库一片段的核苷酸序列有99％的相似性，说明该基因可能与水分逆境胁迫可能有较为密切的关系；cDNA5和10编码的蛋白与转录修复因子35％的相似，与转录相关；DNA片段6编码的蛋白与嗅感觉蛋白有21％的相似；cDNA片段11编码的蛋白质与来源于玉米的过氧化氢酶(catalase，EC1.11.1.6)34％一致，过氧化氢酶与盐胁迫下过氧化伤害的清除有密切关系；cDNA13编码的蛋白质与小麦铝诱导蛋白wali3有60％的相似性；DNA片段14编码的是一新的蛋白，在GenBank中无相似蛋白存在；DNA片段15编码的蛋白与一个小结构蛋白相似；cDNA片段17与β-香树素合成酶基因53％相似，该酶是次生代谢物合成过程的一个酶。定量PCR表明DNA片段4和11与植物的耐盐性有一定的相关性。 谷胱甘肽还原酶是植物体内一类重要的抗氧化酶。以多枝赖草叶片为材料，根据植物谷胱甘肽还原酶(GR)氨基酸保守区序列设计简并引物，通过RT-PCR扩增到1个408bp大小的cDNA片段(Genbank注册号为AY781786)，5'RACE和3'RACE克隆获得5'和3'端序列，拼接得cDNA基因全长包含1580bp，包含一个1140bp的开放阅读框架，编码380个氨基酸。与水稻、玉米、烟草、葡萄、白菜、拟南芥大豆等植物谷胱甘肽还原酶氨基酸序列的同源性在77～92％之间。Southern印迹杂交表明多枝赖草谷胱甘肽还原酶基因在基因组中以单拷贝存在。 Northern杂交和定量PCR分析多枝赖草GR基因在盐胁迫下的表达，随着盐胁迫浓度的增加，GR基因表达加强，150mmol/L和300mmol/L处理时增加显著。150mmol/LNaCl盐胁迫下不同时间处理表明，GR基因随胁迫时间的延长而表达加强；处理24h时，GR基因表达水平最高。ABA(100mol/L)和干旱处理，GR基因也表现出与盐处理相似的上调效应，两种实验方法研究多枝赖草GR基因在胁迫下的表达，可以得到一致的结果，GR基因都出现上调现象，表明GR基因与盐胁迫之间有着非常密切的关系。

目录

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文献综述

第一部分盐胁迫下多枝赖草基因的差异表达第一章前言

第一部分盐胁迫下多枝赖草基因的差异表达第二章多枝赖草总RNA提取、纯化方法的建立

第一部分盐胁迫下多枝赖草基因的差异表达第三章盐胁迫下多枝赖草mRNA差别显示体系的建立

第一部分盐胁迫下多枝赖草基因的差异表达第四章多枝赖草耐盐相关cDNA的克隆与鉴定分析

第二部分多枝赖草谷胱甘肽还原酶基因的克隆及表达分析第一章前言

第二部分多枝赖草谷胱甘肽还原酶基因的克隆及表达分析第二章多枝赖草谷胱甘肽还原酶基因的克隆与分析

第二部分多枝赖草谷胱甘肽还原酶基因的克隆及表达分析第三章盐胁迫下多枝赖草谷胱甘肽还原酶基因的表达

全文结论

附录

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