广西狂犬病野毒株N基因的检测与序列分析

摘要

本研究从广西14个市采集了1278份家犬脑组织，经RT-PCR检测确定为阳性的有35份，其中发病犬检出率为100％(11/11)，外观正常犬检出率为1.89％(24/1267)。与广西报道的人间狂犬病的流行情况相比较，结果发现近年人狂犬病疫情较为严重的市(如百色、防城港市等)，其外观健康家犬的带毒检测却均为阴性，说明外观健康家犬的带毒率和人狂犬病发病率并不成正相关，两者关系有待进一步研究和探讨。 同时，本研究还对采集的3份发病牛脑组织，1份发病猪脑组织和1份正常猫的脑组织，进行了RT-PCR检测，证实其均为阳性。 取上述阳性病料其中的25份进行核苷酸、氨基酸序列分析和绘制遗传进化树分析，结果显示广西的狂犬病病毒分离株属于同一基因型，即基因I型，但可以分为4个亚系。其中亚系Ⅰ有15株占60％，包括GXGL1、GXLZ1、GXYL1、GxGL2、GXGG1、GXNN1、GXNN5、GXWZ1、GXQZ1、GX260、GXCH3、GXCH1、GXCH2、GXNN3、GXNN9，它们的核苷酸同源性在97.6-100％之间，并与国内人用疫苗参考毒株CTN同属一群；第Ⅱ亚系仅有1株，即GXNN6，它与泰国的8738THA 株的核苷酸同源性是95.8％，两者同属一个组群；第Ⅲ亚系有5株，包括GXCH7、GXBS1、、GXHC1、GXGG2、GXQZ4，它们的核苷酸同源性在98.5-100％之间；第Ⅳ亚系为一个新发现的组群，包括GXYL3、GXCH4、GXYL2、GXBH1，它们与ERA株核苷酸的同源性在99.1-99.6％之间。各亚系的核苷酸同源性在84.6％-89-9％间。此外，分析发现这些毒株的分布具有一定的地域特征，亚系Ⅰ主要分布在桂东地区，亚系Ⅱ只有一株出现在南宁，亚系Ⅲ主要分布在桂西地区，而亚系Ⅳ只分离到4株，与疫苗株同源，主要分布在桂东的玉林、北海和崇左。

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第一部分研究综述 狂犬病研究进展

1、病原学

2、流行病学和流行概况

3、诊断与检测

4、分子生物学研究

5、疫苗研究与防治

6、课题的目的和意义

第二部分实验研究 广西狂犬病野毒株N基因检测与序列分析

1、材料与方法

1.1病料

1.2仪器设备

1.3试剂及配制

1.4引物设计

1.5参考毒株

1.6技术线路

1.7犬脑组织及ERA疫苗株的处理

1.8病毒RNA的提取

1.9反转录合成cDNA

1.10聚合酶链式反应(PCR)

1.11 PCR产物的鉴定

1.12 PCR产物的回收纯化

1.13 PCR产物的连接与阳性克隆质粒的鉴定

1.14序列测定与分析

2、实验结果

2.1 RT-PCR检测

2.2重组质粒的酶切鉴定

2.3重组质粒的PCR鉴定

2.4核酸序列分析

3、讨论

3.1关于外观健康家犬带毒

3.2关于外观健康的家犬带毒率和人间狂犬病发病率的关系

3.3关于不同物种带毒

3.4 N基因序列比较及同源性分析

3.5广西狂犬病病毒分布的地理特征性

3.6本课题需要进一步解决的问题及展望

4、结论

参考文献

附录

致谢

攻读学位期间发表的学术论文