环境因子对三萜含量影响的正交分析及羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因的克隆、分析

摘要

灵芝[(Ganoderma lucidum(Leys s．ex．Fr)Karst)]属于真菌界(Mycota)，担子菌亚门(Basidiomycot ina)，多孔菌目(Aphyllophprates)，灵芝菌科(Ganodermatateae)，是我国著名的药用真菌，具有重要的药理作用，作为药物已经有2000多年的历史。三萜类化合物是灵芝的重要药用成分，具有保肝、抗肿瘤、抑制组织胺释放、抑制胆固醇的合成和吸收以及抗HIV和抗HIV蛋白酶的作用等功能。因此，灵芝中三萜含量的高低已经成为灵芝质量高低的重要指标。 三萜的生物合成是通过甲羟戊酸途径，由法呢酯焦磷酸产生鲨烯、再转化成2，3-氧化鲨烯，最后经过-系列的氧化、还原和环化反应形成的。其中，羟甲基戊二酰辅酶A还原酶(}tMG-CoA还原酶)以2分子NADP(H)为辅酶，催化HMG-CoA(羟甲基戊二酰辅酶A)生成甲羟戊酸，是三萜合成中的关键酶。因此，HMG-CoA还原酶的含量和活性决定了三萜产生的多少。 用单因素实验和正交实验两种方法研究了外界培养条件对灵芝产三萜含量的影响。单因子实验中，研究了不同的碳源、氮源、无机盐和pH对灵芝三萜含量的影响，结果表明最适合的碳源(A)、氮源(B)、无机盐(C)和pH(D)分别是蔗糖，黄豆饼粉或蛋白胨，FeSO<,4>，pH6.0。选取四个因子中较好的三个水平进行正交实验，结果表明：四个因素对三萜含量影响的大小为：A>C>D>B，其中A因素最好水平是A<,2>(蔗糖)，其水平效应值为+0.34 mg/100mg DW；最好的处理组合是A<,2>B<,1>C<,3>D<,1>(蔗糖、黄豆饼粉、氯化钙、pH4.0)，三萜含量达2.63±0.011mg/100 mg DW；无机盐和氮源、pH之间交互作用非常显著(P<0.01)，互作效应最大的是(B<2> x D<,2>)，效应值达+0.19 mh/100mgDW，大于因素本身B2(蛋白胨)和D<,2>(pH5.0)的水平效应值，表明不同因素间的交互作用不能忽略。不同培养条件下三萜含量变化的确定为今后研究三萜合成中关键酶HMG—coA还原酶的表达调控奠定了基础。 根据已报道的HMG-CoA还原酶氨基酸序列，针对保守区域设计简并引物，扩增出基因特异片段，长511bp。 根据获得的特异片段，设计专一引物，通过三次SEFA-PCR的方法，以灵芝基因组DNA为模板，克隆到了基因组全长序列，该序列全长4262bp。 提取灵芝原基时期的RNA，反转录为cDNA作为模板，扩增得到全长cDNA序列，该序列长3681bp，编码产生1226个氨基酸。其推导的氨基酸序列分子量为131.17KD。 将灵芝HMG-Coh还原酶基因全长cDNA序列和基因组DNA序列进行比对分析，发现灵芝HMG—CoA还原酶基因全长中，含有7个外显子和6个内含子。 将灵芝HMG-Coh还原酶基因全长cDNA序列进行Blast分析，发现与基因具有较高同源性的物种是新型隐球菌(C.neoformans)，两者N一端同源性达到46％，C-端保守催化域同源性达到83％。 对灵芝HMG-Coh还原酶基因进行一系列生物信息学分析，发现HMG-CoA还原酶基因内存在2个保守的HMG-CoA结合位点E(838)和T(867)和2个NAD(H)结合位点D(963)和G(1112)；含两段PEST序列K(653)和R(725)；对跨膜结构域进行预测，发现蛋白内含3个跨膜结构，分别位于氨基酸：V(13)-L(35)、L(222)-A(244)、N(251)-L(270)；在N-端存在1个信号肽序列，最可能的切割位点在第30和第31个氨基酸之间：TLA-YF；对HMG-CoA还原酶二级结构进行预测，发现了1个依赖于cAMP的蛋白激酶的磷酸化结合位点以及12个蛋白激酶c磷酸化位点。其二级结构内，有41.5％螺旋结构，11.3％的折叠结构和47.1％的无规则卷曲。利用C1ust x和MEGA3.0建了灵芝HMGR基因的系统进化树，发现其与真菌界中担子菌亲缘关系最为密切，进化关系符合经典的物种分类的结果。 通过竞争性RT-PCR的方法，研究了不同碳源培养条件下，灵芝HMG-CoA还原酶基因的表达情况，表明不同碳源培养条件HMG-CoA还原酶基因表达量有所差异，这种差异与三萜含量的变化呈正相关。 根据灵芝HMG-CoA还原酶基因组DNA序列，设计引物，以总基因组DNA为模板，扩增了其上游启动子序列，该序列长约2Kb，用Soflberry软件对启动子序列进行分析，发现灵芝HMG-CoA还原酶基因启动子中没有明显的TATA-box，而与人和hams ter相似，存在一个TTATT-box；含有TFⅡ-Ⅰ、GATA一1、Gc-box、NF-Y等重要的转录因子的结合位点；并发现了SRE-1、SREBP、CREB等重要的与甾醇调节相关的顺式调控元件。

目录

文摘

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文献综述

一、灵芝的分类地位

二、灵芝药用价值的研究

三、灵芝分子生物学研究

四、HMG-CoA还原酶的研究进展

五、定量RT-PCR技术

参考文献

第一章培养条件对灵芝三萜含量影响的正交分析

引言：

1实验材料

2实验方法

3实验结果

4讨论

参考文献

第二章灵芝HMG-CoA还原酶基因的克隆及其表达谱分析

引言：

第一节灵芝HMG-CoA还原酶基因的克隆

1实验材料

2试验方法

3结果与分析

第二节竞争性RT-PCR法检测不同碳源培养条件下HMG-CoA还原酶基因的表达

引言：

1实验材料

2实验方法

3实验结果

4讨论

参考文献

第三章灵芝HMG-CoA还原酶基因启动子的克隆及其序列分析

引言：

1材料和方法

2结果与分析

3 讨论

参考文献

全文总结

附录

致谢

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