一种富含有机硒的益生菌制剂的研制与作用机理研究

摘要

硒是人和动物必需的微量元素之一，具有调节机体代谢、提高机体免疫力和抗病力、影响人和动物的生殖机能、抗肿瘤、抗自由基、延缓衰老和拮抗有毒元素等多种重要的生物学功能，所以日粮补硒现已是许多国家养殖业采取的常规措施。当前广泛使用的补硒方法是添加无机硒--亚硒酸钠，但由于亚硒酸钠利用率低、毒性大，其本身具有过氧化作用，而且对环境会造成潜在的污染，因此一些国家已经限制使用亚硒酸钠作为硒的营养补充剂。有机硒与无机硒相比有许多优势，首先其毒性较小，适口性好，便于在饲料中应用。此外因其吸收利用率更高，可降低饲料中硒的添加量，从而减少对环境的污染。目前生产上应用的有机硒主要是富硒酵母，但由于富硒酵母的价格相对较高，其推广应用受到了一定的限制。益生菌具有维持肠道菌群平衡、防治胃肠道疾病，产生多种酶类、合成多种营养物质、促进生长，增强机体免疫机能等生物学功能，目前广泛作为饲料添加剂应用。
　　 本研究试图通过筛选益生菌菌株，优化培养条件，研制有机硒转化促进剂，观察其应用效果以及评价其安全性等途径研制一种具有有机硒和益生菌双重作用的富硒益生菌制剂。在此基础上研究富硒益生菌制剂的作用机理，为其在畜牧生产上的广泛应用提供理论依据。
　　 试验1富硒益生菌菌株的筛选与培养条件的优化本试验对9株益生菌进行了筛选，然后对筛选出的益生菌的混合培养条件进行了优化，同时研制了促进益生菌将无机硒转化为有机硒的促进剂。结果显示，产朊假丝酵母Y2和嗜酸乳杆菌L7可作为研制富硒益生菌的菌株。富硒益生菌的培养条件为：特定的培养基，装液量100mL/500mL三角瓶，7.5 mg·L-1的Se4+浓度、在培养15 h时后加入Se4+，30℃培养36h。在该培养条件下，在添加有机硒转化促进剂的情况下，加入不同质量的玉米淀粉进行吸附、离心、真空抽干后获得的三种富硒益生菌产物的量分别为262.97、146.48和74.43 g·L-1，硒含量分别为28.58、51.26和100.82 mg·kg-1，产朊假丝酵母菌数分别为4.20x108、4.60×108和1.29×108 cfu·g-1；嗜酸乳杆菌数分别为3.50x1010、2.91×1010和0.94×1010 cfu·g-1。
　　 试验2培养液中添加硒对益生菌形态与活性的影响本试验研究在富硒益生菌培养过程中添加无机硒对富硒益生菌中的产朊假丝酵母和嗜酸乳杆菌的形态结构以及活性的影响。将产朊假丝酵母和嗜酸乳杆菌分别混合或单独培养于不加硒和含硒7.5 mg·L-1的培养基中，30℃培养36 h后，分别通过光学显微镜和电子显微镜观察产朊假丝酵母和嗜酸乳杆菌的形态变化；同时，将来自于不加硒和含硒培养液中的产朊假丝酵母和嗜酸乳杆菌数量分别调整为5×107cfu·mL-1和5×1.08cfu·mL-1，并重新分别接种到YEPD或MRS培养基中培养，36 h后分别对培养液进行细菌计数。结果显示：与不加硒培养获得的产朊假丝酵母菌和嗜酸乳杆菌的形态和活性相比，在含硒培养基中培养的产朊假丝酵母菌和嗜酸乳杆菌的形态和活性均未见改变。结果表明：在培养过程中向培养基中加入适量的硒，对富硒益生菌中的产朊假丝酵母和嗜酸乳杆菌的形态和活性不产生影响。
　　 试验3富硒益生菌中硒的形式与含量测定建立了氢化物发生-原子荧光光谱法测定富硒益生菌中总硒和有机硒的方法，研究了仪器的工作条件、试剂对硒测定的影响，探讨了消化试剂对样品消化的影响和共存离子的干扰及消除。结果显示，在优化的工作条件下，硒的检出限为0.0785μg·L-1，相对标准偏差为0.45％，线性范围为0-100μg·L-1；应用该方法检测三种富硒益生菌产物，其总硒含量分别为100.82μg·g-1、51.26μg·g-1和28.58μg·g-1，其中有机硒含量分别为93.53μg·g-1、47.19μg·g-1和26.18μg·g-1，加标回收率在97.62％-102.80％之间.建立了气相色谱。质谱法测定富硒益生菌中硒蛋氨酸含量的方法，比较了3种从样品中提取硒蛋氨酸方法的效果，确定最佳提取和测定条件为在Tris-缓冲液中酶解24 h，使用丁醇酯化，三氟醋酸酐酰化的衍生方法，采用选择离子m/z349进行测定，外标法定量。在此条件下，硒蛋氨酸的检出限为0.5 mg·U-1，加标回收率在98.34％-103.84％之间，相对标准偏差为0.96％-1.87％；测定三种富硒益生菌产物中硒蛋氨酸含量分别为156.40μg·g-1、74.88μg·-1和42.50μg·g-1.
　　 试验4富硒益生菌的安全性评价本试验对富硒益生菌分别进行小鼠急性毒性试验、蓄积毒性试验、Ames试验、小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验和精子畸形试验研究。结果显示，小鼠经口摄入富硒益生菌，其LD50>31.25 g·kg-1；在试验剂量范围内，富硒益生菌未表现出蓄积毒性，Ames试验、微核试验和精子畸形试验结果均为阴性。结果表明，作为硒的营养补充剂，富硒益生菌的安全性远远高于亚硒酸钠，更适于在生产实践中应用。
　　 试验5富硒益生菌对小鼠抗氧化能力、免疫功能及肠道菌群的影响140只小鼠随机均分为对照组、亚硒酸钠组、富硒酵母组、富硒益生菌组和益生菌组，每天分别灌胃蒸馏水、亚硒酸钠（2μg Se·mL-1）、富硒酵母（2μg Se·mL-1）、富硒益生菌（2μgSe·mL-1）和益生菌各0.5 mL，连续28 d。于试验11 d，每组随机选择8只小鼠腹腔注射SRBC0.2 mL进行免疫，于试验15 d，测定免疫小鼠血浆IL-2和脾脏细胞空斑形成细胞溶血能力；试验结束时，测定小鼠脏器指数、脾脏淋巴细胞转化率、腹腔巨噬细胞活性、全血GPX活性、血浆SOD、MDA水平、盲结肠中葡萄球菌、大肠杆菌、肠球菌、双歧杆菌及乳杆菌数量。结果显示，胸腺指数与腹腔巨噬细胞活性，富硒益生菌组显著或极显著高于其他4组；脾脏指数，富硒益生菌组显著高于对照组、亚硒酸钠组和益生菌组；脾脏淋巴细胞转化率、血浆IL-2和空斑形成细胞溶血能力，富硒益生菌组显著或极显著高于对照组和益生菌组；GPX与SOD活性，富硒益生菌组显著或极显著高于对照组和亚硒酸钠组；MDA水平，富硒益生菌组极显著低于对照组和亚硒酸钠组；小鼠肠道中葡萄球菌、肠球菌和肠杆菌的数量，富硒益生菌组显著或极显著少于对照组、亚硒酸钠组和富硒酵母组；小鼠肠道中乳酸菌的数量，富硒益生菌组极显著高于对照组、亚硒酸钠组和富硒酵母组。结果表明，富硒益生菌具有提高小鼠免疫功能和抗氧化能力、调节肠道菌群的功能；其提高小鼠免疫功能的效果优于富硒酵母、亚硒酸钠和益生菌，提高小鼠抗氧化能力的效果优于亚硒酸钠，调节肠道菌群的功能优于富硒酵母和亚硒酸钠。
　　 试验6富硒益生菌对小鼠肝脏GPX-1和IDⅠ mRNA表达的影响80只小鼠随机均分为对照组，亚硒酸钠组，富硒酵母组，富硒益生菌组，每天分别灌胃蒸馏水、亚硒酸钠（2μg Se·mL-2）、富硒酵母（2μg Se·mL-2）、富硒益生菌（2μg Se·mL-1）和益生菌各0.5 mL，连续28 d。于实验28 d，每组随机选择10只小鼠，应用实时定量PCR方法检测其肝脏GPX-1和IDI基因mRNA表达水平。结果显示，富硒益生菌组、富硒酵母组和亚硒酸钠组小鼠肝脏GPX-1和IDI基因mRNA表达水平均显著或极显著高于对照组，但富硒益生菌组、富硒酵母组和亚硒酸钠组之间没有显著差异。结果表明，补充富硒益生菌能够提高GPX-1和IDI基因mRNA表达水平，进而提高GPX-1和IDI合成。但其提高GPX-1和IDI基因mRNA表达水平的效果与富硒酵母和亚硒酸钠相比没有差异。
　　 试验7富硒益生菌对羔羊生产性能、硒状态及T3、T4含量的影响50只滩羊羔羊，随机均分为对照组、富硒益生菌组、富硒酵母组、亚硒酸钠组和益生菌组。对照组饲喂基础日粮；益生菌组日粮中添加益生菌；其余3组日粮中分别添加富硒益生菌、富硒酵母和亚硒酸钠，其剂量以硒计均为0.1 mg·kg-1饲料。整个试验期为56 d。在试验0 d和56 d分别测定生产性能相关指标；在试验0 d、28 d和56 d分别测定全血硒含量、全血GPX浓度和血浆T3、T4水平。结果显示，富硒益生菌组羔羊平均增重显著高于对照组，料重比显著低于对照组；在28 d和56 d时，富硒益生菌组羔羊全血GPX浓度和全血硒含量，均显著或极显著高于对照组和亚硒酸钠组；在28 d和56 d时，富硒益生菌组羔羊血浆T3水平显著高于对照组，而血浆T4水平显著低于对照组。结果表明，富硒益生菌能够提高羔羊的生产性能、改善机体硒状态、升高血浆T3水平、降低血浆T4水平。
　　 试验8富硒益生菌对羔羊组织硒含量、抗氧化能力及细胞因子水平的影响试验设计同试验7。在试验56 d，分别采取肝脏、肾脏和肌肉测定其硒含量；在试验0 d、28 d和56 d分别测定全血GPX活性、血浆SOD活性、MDA、IL-1，IL-2和TNF-a浓度。结果显示，富硒益生菌组羔羊肝脏、肾脏和肌肉硒含量均极显著高于对照组和亚硒酸钠组；在28和56d，富硒益生菌组羔羊全血GPX活性均显著或极显著高于对照组和亚硒酸钠组，富硒益生菌组羔羊血浆SOD活性极显著高于对照组，而血浆MDA含量均显著或极显著低于对照组和亚硒酸钠组；富硒益生菌组羔羊血浆IL-1、IL-2和TNF-a浓度均显著或极显著高于对照组。结果表明，富硒益生菌能够增加羔羊的组织硒含量、改善机体抗氧化能力、提高血浆细胞因子浓度。

目录

文摘

英文文摘

符号及缩略语说明

前言

第一篇 文献综述

第一章 微量元素硒及其生物学作用研究进展

1 硒的理化性质与分布

2 硒在机体内的分布与代谢

3 硒的生物学作用

参考文献

第二章 硒的生物有机化研究进展

1 微生物合成转化法

2 植物天然合成转化法

3 植物种子发芽转化法

4 硒的动物转化

参考文献

第三章 益生菌的研究进展

1 动物肠道微生态系统及其生理功能

2 益生菌的概念

3 益生菌作用的基本理论概述

4 益生菌的种类

5 益生菌的功能

6 益生菌的应用

7 国内外目前的益生菌研究热点

参考文献

第二篇 试验研究

第四章 富硒益生菌菌株的筛选与培养条件的优化

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

参考文献

第五章 培养液中添加硒对益生菌形态与活性的影响

1 材料与方法

2 结果与讨论

3 结论

参考文献

第六章 富硒益生菌中硒的形式与含量测定

1 材料与方法

2 结果与讨论

3 结论

参考文献

第七章 富硒益生菌的安全性试验研究

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

参考文献

第八章 富硒益生菌对小鼠抗氧化能力、免疫功能及肠道菌群的影响

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

参考文献

第九章 富硒益生菌对小鼠肝脏GPX-1和ID Ⅰ mRNA表达的影响

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

参考文献

第十章 富硒益生菌对羔羊生产性能、硒状态及T3、T4含量的影响

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

参考文献

第十一章 富硒益生菌对羔羊组织硒含量、抗氧化能力及细胞因子水平的影响

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

参考文献

全文结论

本文创新点

致谢

攻读博士学位期间发表的学术论文