樟芝深层发酵活性物质的研究

摘要

樟芝Antrodia camphorata是主要分布在中国台湾山区海拔450～2000米之间的牛樟树腐朽的心材内壁的珍稀药用真菌。 樟芝多糖和樟芝三萜是樟芝(Antrodia camphorata)的主要生物活性成分。据文献报道，樟芝具有保肝、抗肿瘤、抗氧化、免疫调节、解毒、抗炎等功效，有很好的药用价值，是一种极具开发潜力和应用前景的药用菌，近年来成为国内外研究和开发的热点。获得樟芝生物活性成分的途径有两种，一种是从子实体中提取，一种是从发酵产物中获取。子实体质量不稳定易受栽培环境影响，而且栽培周期长，一般需要2～3个月或者是更长的时间，发酵获取的目标产物，可通过发酵条件的控制来保证质量稳定且生产周期短。 本研究以樟芝菌丝体生物量和胞内三萜为目标产物进行了发酵工艺的优化，并研究了其发酵产物的代谢规律。确定发酵培养条件为：40 g/L葡萄糖， 6 g/L豆饼粉，1 g/L K<,2>HPO<,4>，0.5g/L MgSO<,4>，V<,81> 100mg/L，自然pH，接种量为20％，装液量为100mL/250mL三角瓶，转速100r/min，26℃恒温培养6d，胞内三萜产量达15.25mg/100mL；菌丝生物量是0.53g/100mL。樟芝在培养对数生长期后期接种，即72h，而大约168h后进入衰亡期，菌体自溶，衰亡，菌丝生物量缓慢下降，胞内三萜产量也随之下降。因此樟芝发酵时最好在72h左右接种，可以避免或缩短停滞期，缩短发酵周期，收集胞内三萜时可在稳定期，即72～168h左右，此时菌丝生长和次生代谢产物积累达最高。 将樟芝深层发酵菌丝体用不同溶剂提取胞内三萜类物质，结果表明用甲醇静置过夜、乙醇静置过夜、甲醇超声波提取和95％的乙醇超声波提取的提取物HPLC图谱中峰的高度基本相同，峰数也相同，各峰的分离度也好，而用沸水和碳酸氢钠提取，峰比较少，峰高比较矮，分离度不好，考虑到甲醇较乙醇毒性更强的特点，本研究采用不同浓度的乙醇不同时间超声波提取樟芝三萜类物质，采用HPLC图谱与体外抗肿瘤实验相结合的方法。研究表明，在50μg/mL时， A、D、E、F四种方法的提取物对肿瘤细胞株L1210均有较强的抑制作用，抑制率超过了50％，与α=0.68时，A、D、E、F有一共同的色谱峰相对应，只是相对面积有所不同，相对面积大的对肿瘤细胞的抑制率相对也表现得比较明显；也是在50μg/mL时，D、E两种方法提取的三萜组分对SW620的抑制率超过了50％，与α=0.63和α=0.68时，D、E也有共同的色谱峰相对应，相对面积差不多。这为以后在α=0.63和α=0.68处进一步分离纯化获得樟芝抗肿瘤活性成分奠定了良好的理论基础。樟芝菌体培养结束后，去除菌丝体，将3份100mL的发酵滤过液分别用无水乙醚(E)、戊烷：无水乙醚(P/E)=1∶1、戊烷：二氯甲烷(P/D)=2∶1多次萃取，合并萃取液用无水硫酸钠干燥，挥干有机溶剂，最终获得约1mL具有浓郁芳香气味的油状物质待用。 GC-MS分析结果表明，三种不同溶剂提取樟芝发酵液所得的化合物数量存在着明显的差异，这可能与溶剂的极性有关。在用P/E混合溶剂提取所得的化合物最多，可达45种，包括8种酯类，16种醇类，5种酸类，2种醛类，5种杂环类，4种碳氢化合物和5种酮类化合物。用溶剂E和混合溶剂P/D提取所得的化合物只有40种和20种。分别包括5种酯类，15种醇类，5种酸类，3种醛类，6种杂环类，2种碳氢化合物和4种酮类化合物以及9种酯类，4种醇类，2种酸类，1种醛类，1种杂环类，2种碳氢化合物和1种酮类化合物。 GC-0分析结果表明，有着甜味的乙酸乙酯，桃子味的γ-十一内酯，柠檬香和花香的芳樟醇以及浓郁的牛奶香的3-羟基-2-丁酮都存在于不同溶剂提取的成分中，组成了樟芝发酵液特殊的香味。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：名词缩写

声明

文献综述

一、樟芝的分类的地位

二、樟芝的起源、分布、形态特征、营养价值及生物学特性

1.樟芝的起源

2.樟芝的分布

3.樟芝的形态特征

4.樟芝的营养成分

5.生物学特性

三、樟芝的药用价值

1.抗肝炎作用

2.对肝损伤的保护作用

3.免疫增强作用

4.抗氧化作用

5.抗炎症作用

6.其他作用

四、樟芝人工栽培的前景和目前研究的现状

1.樟芝人工栽培的前景

2.樟芝目前研究的现状

五、食、药用菌液体发酵的特点及概况

1.食、药用菌液体发酵的特点

2.食、药用菌液体发酵概况

3.食、药用菌液体发酵产物主要用途

4.发酵产物的分析手段

六、发酵条件的影响

1.营养因子对深层发酵目标产物的影响

2.非营养因子对深层发酵目标产物的影响

七、食、药用真菌活性物质的研究

1.真菌三萜类物质的研究

2.真菌多糖研究

八、挥发油(精油)

1.挥发油的分布

2.挥发油的性质

3.挥发油的组成

4.挥发油的提取

5.挥发油成分的分离

6.挥发油的生物活性和应用

九、GC-MS的发展

十、本研究的目的与意义

材料与方法

一、材料

(一)仪器

(二)试剂

(三)材料

二、方法

(一)、培养基的筛选及优化

(二)、非营养因子的优化(摇瓶培养)

(三)、樟芝菌丝体三萜类物质的研究

(四)、樟芝菌丝体多糖类物质的研究

(五)、芳香物质的提取

结果与分析

一、培养基的筛选及优化

1.营养因子的单因子筛选

2.不同范围营养因子的筛选实验

3.营养因子的正交实验

二、非营养因子的优化(摇瓶培养)

1.最适接种量的筛选

2.最适pH的筛选

3.转速的筛选

4.装液量的筛选

5.最适培养温度的筛选

6.代谢产物的代谢规律

三、樟芝菌丝体三萜类物质的研究

1.樟芝菌丝体三萜提取方法的比较

2.色谱指纹图谱的建立

3.菌丝体三萜的抗肿瘤实验

四、樟芝菌丝体多糖类物质的研究

1.樟芝多糖得率的测定

2.樟芝多糖提取物对小鼠淋巴细胞的作用

五、发酵液中挥发油成分的分析

1.GC-MS的测定结果

2.GC-O的测定结果

讨论

一、樟芝胞内三萜高产量菌株发酵条件的优化

二、樟芝胞内三萜类化合物提取方法的研究

三、樟芝胞内三萜类化合物抗肿瘤活性的研究

四、樟芝菌丝体多糖类物质的研究

五、樟芝发酵液中挥发油成分的分析

全文总结

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间，发表文章情况