慢病毒载体法高效转基因鸡制备技术研究

摘要

转基因鸡模型系统在生命科学领域有着广泛的应用，如作为生物反应器在鸡蛋中表达功能蛋白、禽类育种及用于胚胎发育生物学基础研究等。本研究的主要目的是探索并建立基于HIV-1慢病毒载体法高效转基因鸡制备技术体系，初步生产表达人类药用蛋白——组织纤溶酶原激活剂(tPA)转基因鸡，并建立输卵管特异表达启动子筛选体系，为今后输卵管生物反应器的开发应用及转基因育种作预备。 为研究方便，首先以增强型绿色荧光蛋白(EGFP)为标记基因构建了基于HIV-1的复制缺陷型慢病毒载体，并生产病毒(病毒滴度10<'6>个转染单位/ml)，。病毒感染不同来源、不同分化特征的细胞，在所有类型细胞中均可检测到EGFP较高水平的表达，其中在Hela、293FT细胞中的转染效率约为10<'8>转染单位/ml，C127中为5×10<'7>转染单位/ml，，鸡胚胎成纤维(CEF)约10<'6>转染单位/ml，病毒在鸡原生殖细胞中转染效率最低为10<'2>转染单位/ml。病毒的感染可引起细胞表型的不利改变。用该病毒注射鸡囊胚获得了绿色荧光信号可直接活体观察的转基因鸡。试验中分两次共注射204只鸡胚，孵化出30只，孵化率15％，其中16只经点杂交分析及PCR分析有外源基因的整合，转基因效率53％，在其中两个雄性转基因个体的后代中发现了外源基因的整合，表明发生了生殖嵌合现象。在活体中有4只可从体表通过激发荧光而直接观察到绿色荧光信号。荧光信号在不同个体、不同的体表部位表现出不同的表达特征，多呈点状分布，主要集中在喙及鸡冠两侧、鼻、耳、爪等皮肤裸露处，前胸、面部等羽毛稀疏处。进一步解剖分析表明，外源基因在不同组织中的表达强度、表达特性是不一样的，尤以大、小肠中的表达最为强烈为弥散型分布，而在肝脏中发现非均质点状分布。在成年个体皮肤、肝脏、胰脏、小肠及血管的组织切片中也发现了强烈的绿色荧光信号，最为重要的是在睾丸中也发现了强烈的荧光信号，绿色荧光集中于睾丸曲细精管管周。同时试验中还初步探索了以LM-PCR方法分析外源基因整合位点的可行性。以上结果表明基于HIV-1的慢病毒载体可以较低的费及较低的设备要求用于高效制备转基因家禽。 在前者研究基础上，进一步构建了表达人类组织型纤溶酶原激活剂的慢病毒载体，在载体中tPA和绿色荧光蛋白以Asp-Pro蚁酸敏感位点结成融合蛋白。用病毒共注射了34只鸡胚，孵化出7只，孵化率20.6％，其中两只经PCR及点杂交方法检测有外源基因的整合，两只个体均为雄性。由于蛋白融合后可能会影响GFP蛋白的荧光表达，在两只转基因个体的体表均没有发现直接可视的绿色荧光信号，但经免疫荧光分析后在其中一只个体的胰腺中发现了较弱的目的蛋白的表达。用F板检验法，在转基因鸡胰脏及肝脏中检测到tPA重组蛋白有较高的生物酶活性的。家禽作为生物反应器表达药用蛋白最为人关注同时也最能表现其生产应用价值的地方是实现在输卵管中的特异/高效表达。而实现这一目标的关键是筛选合适的启动子。为此克隆了SV40大T抗原(TAG)基因全序列，并构建了表达TAG的neo抗性慢病毒载体，生产病毒后，侵染新开产蛋鸡输卵管上皮原代培养细胞，筛选建立了永生化输卵管上皮细胞，经永生化后细胞的增殖能力有所改善。以此为基础评价不同启动子的表达效果。共克隆并构建了两种含有不同长度卵清蛋白(OV)启动子的Blasticidin抗性慢病毒载体，启动子分别为OV1345及OV2964，两种启动子除后者多了第一内含子外其余序列均相同。两种病毒感染永生化输卵管上皮细胞后，经筛选稳定整合细胞后，提取DNA及mRNA分别进行定量分析，结果表明从DNA整合效果上看，含OV1345启动子的病毒是含OV2964启动子病毒整合效率的46倍，但mRNA表达量前者却只有后者的14倍，以mmNA表达量与DNA整合拷贝数的比值作为拟单拷贝基因转录数来反映不同启动子的转录效率，可以发现OV2964启动子的转录效率可达OV1345启动子的3倍，说明第一内含子对OV启动子的转录起正向调节作用。虽然所有两个病毒感染的细胞中均没有可发现的绿色荧光信号，但从定量结果上看，永生化输卵管上皮细胞具有部分不同于成纤维细胞的正常输卵管上皮细胞的生理特性。

目录

文摘

英文文摘

声明

文献综述

第一章转基因家禽研究进展

1转基因家禽的发展潜力

2家禽转基因操作面临的困境及可能战略

第二章HIV-1来源慢病毒载体

1 HIV的生物学特性

2病毒载体

实验部分

第一章慢病毒载体介导绿色荧光蛋白基因在鸡体内的高效整合与表达

1材料与方法

2结果

3讨论

第二章组织型纤溶酶原激活剂在鸡体内的表达

1材料与方法

2结果

3讨论

第三章鸡输卵管特异/高效表达启动子筛选体系的建立

1材料与方法

2.结果

3讨论

参考文献

全文结论

创新之处

攻读学位期间发表及待发表的学术论文

致谢