慢病毒转染鸡胚原始生殖细胞及性腺嵌合体鸡的制备

摘要

原始生殖细胞(Primordial germ cells，PGCs)是精子或卵子的祖先细胞，是一种多能干细胞。由于原始生殖细胞可以直接将外源基因传给后代，故以其作为转基因载体生产转基因鸡具有广阔的前景。体外分离培养PGCs，并对其进行遗传操作，再将整合有外源基因的PGCs重新注入鸡胚血管中，就可获得性腺嵌合体，生产出稳定遗传的转基因后代。 本实验从孵化5.5d的伊萨鸡胚生殖嵴中分离原始生殖细胞，经Ficoll密度梯度离心纯化PGCs细胞，通过PAS(过碘酸希夫试剂)和AKP(碱性磷酸酶)染色鉴定，其纯度可达70％。同时分离孵化5.5d的鸡胚性腺基质细胞作为饲养层，在添加多种生长因子(白血病抑制因子mLIF、成纤维细胞生长因子bFGF、白介素-11 IL-11、胰岛素样生长因子hlGF-Ⅰ、干细胞生长因子hSCF)的条件下培养PGCs细胞，探索其体外培养的最佳条件。 本实验构建了pLenti6-eGFP慢病毒表达载体，与辅助质粒共转染293FT细胞生产病毒颗粒。将慢病毒浓缩后转染鸡胚PGCs，转染率高达24.19％。通过显微注射的方法，将转染外源基因的PGCs供体细胞，浓缩后注入孵化2.5d的受体鸡胚血液中，接受了供体PGCs细胞的受体鸡胚继续孵化至第8d。之后提取受体鸡胚基因组DNA进行PCR检测，结果显示：在检测的42只受体鸡胚中，有2只发生性腺嵌合，嵌合率为4.8％。 本研究建立了分离PGCs、体外培养PGCs、制备嵌合体的方法，不仅可以提供丰富的供体细胞来源，还为转基因鸡的成功制备创造条件。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略语的中英文对照

声明

引言

第一部分文献综述

第一章鸡胚原始生殖细胞(PGCs)的生物学特性

1 PGCs的形态和特性

2 PGCs的起源

3 PGCs的迁移规律

4 PGCs的体外培养

5 PGCs的体外鉴定

6 PGCs的研究进展和应用前景

第二章转基因鸡研究进展

1转基因鸡的制备方法

2转基因鸡研究存在的问题

3本实验的目的与意义

第二部分实验研究

第一章鸡胚原始生殖细胞的体外培养

1实验材料

2实验方法

3实验结果

4讨论与分析

第二章慢病毒载体体外转染鸡胚原始生殖细胞

1实验材料

2实验方法

3结果

4讨论与分析

第三章性腺嵌合体鸡的制备和分子鉴定

1实验材料

2实验方法

3结果

4讨论

全文结论

参考文献

附 录

致谢