核黄素受体蛋白对植物开花转型和抗病防卫调控作用的初步研究

摘要

核黄素在生物体内以黄素单核苷酸FMN及黄素腺嘌呤二核苷酸FAD的形式作为黄素酶的辅酶，参与机体组织呼吸链电子传递及氧化还原反应。核黄素参与植物抗氧化及过氧化过程，从而影响氧化性损伤及后续过敏反应过程中活性氧中间体(reactive oxygen intermediates，ROIs)的产生。ROIs是过敏细胞坏死的重要信号，能调节生长、抗病、抗虫、抗逆，所以核黄素与植物免疫反应有关。研究发现，多种植物体外施核黄素后，生长加快、作物产量提高、抗逆能力增强，并且启动未知的抗病信号通路而抗病增强。我们假设植物中内源核黄素含量的变化可能影响相关生理生化过程，进而参与了植物的抗病防卫和生长发育。我们以此为切入点，着手研究核黄素参与调控植物生长和防卫的机制及与基本防卫通路的交叉对话。 本实验室已有整合中华鳖核黄素受体基因(riboflavin receptor protein，RIR)的转基因拟南芥株系。已有研究结果表明转基因拟南芥植株中导入外源的基因促使内源核黄素总含量的升高；与野生型相比，转基因植株生长加快、个体较大、开花提前；丁香假单胞番茄致病变种Pseudomonas syringae pv．tomato DC3000在转基因植株上发病症状减轻，细菌繁殖相对缓慢。针对转基因植株出现的有益表型，我们展开系列研究，探讨核黄素受体影响核黄素含量的机制及后续反应中相关基因的表达特征和基本通路的开启交叉细节。 本文用PCR(polymerase chain reaction)的方法从含有软体海龟编码核黄素结合蛋白(riboflavin receptor protein，RIR)基因的质粒中克隆出该基因，将RIR基因与原核表达载体pET30a(+)重组并进行表达，聚丙烯酰胺凝胶(SDS)电泳表明蛋白质的大小35kD，以BL21(DE3)pLysS作宿主菌，1 mM IPTG(isopropyl-1-thio-β-D-galactoside)诱导4小时，融合蛋白His-taggeal RIR表达量达最大。体外RIR能与核黄素结合而淬灭核黄素的自发荧光，表明RIR具有生物活性。本文研究结果可为今后研究核黄素受体蛋白调节核黄素含量参与植物生长发育调控的机制奠定基础。 作为后续实验基础，研究了转RIR基因株系RIRA18的遗传背景。RIRA18作为父本，回交统计实验F<,2>代以卡那抗性3：1分离，卡那抗性基因为显性，符合孟德尔单基因位点控制的分离规律；同时反向PCR策略扩增T-DNA插入片段侧翼序列，结果为单条带，测序得到的序列经比对为拟南芥第二染色体18S和25S的一段间隔序列，即为转基因单元的插入位点。这两项结果表明RIRA18含单转基因拷贝，且RIR的表型并非由插入点基因的破坏而产生。运用转基因和人工授粉的方法将转基因单元或RIR位点与基本通路的突变体etr1-1，ein2；aux1-7，jar1-1，abi1-1，npr1-1进行整合，在F<,1>、F<,2<代运用相应平板筛选及分子鉴定、表型辅助判断等手段鉴定杂交品系单株，为研究核黄素参与调控植物防卫和生长的交叉点提供基础材料。 为验证转基因植株开花提前，运用Real Time相对定量2<'-△△Ct>策略，比较Col-0和RIRA18从日出0 h、4 h、8 h、12 h、16 h、20 h各时间段光周期光受体基因PHYA、PHYB、CRY1、CRY2、中心振荡器组分TOC、 CCS和下游的SOC、FT的节律表达情况。RIRA18中光受体基因和中心振荡器组分表达都上调，效应基因SOC、FT的表达水平不如野生型，而与表型不符。本实验结果为进一步的研究提供了线索。RIRA11的芯片实验显示部分防卫基因表达增强，选取8个基因用实时定量进行验证，结果表明这些基因在RIRA11中表达相对Col-0上调，验证了芯片数据，且防卫基因表达上调与转基因植株抗病增强的表型一致。

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文摘

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论文说明：缩略语

声明

第一章核黄素及核黄素受体蛋白(riboflavin receptor protein，RIR)的生物学功能

一、核黄素的生理功能及合成过程

二、核黄素与光信号传导

三、核黄素与植物生长和防卫

四、核黄素受体生物学功能

第二章实时荧光定量技术及应用

一、Real Time PCR概念及原理

二、Real Time的技术特点

三、Real Time技术分类及应用

第一章核黄素受体蛋白RIR的原核表达与生物功能分析

摘要

前言

1材料和方法

2结果与分析

4讨论

第二章RIR转基因拟南芥株系RIRA18的遗传分析及与基本通路突变体杂交品系的产生

摘要

前言

1材料与方法

2结果和分析

3讨论

第三章RIR转基因拟南芥株系的开花转型和抗病防卫反应基因的表达特征

摘要

前言

1材料与方法

2结果和分析

4讨论

参考文献

已发表的论文清单

致谢