富含不同阳离子氨基酸抗菌肽的表达及其生物学活性研究

摘要

众所周知，在抗生素大量使用甚至滥用的今天，细菌对抗生素产生广泛的耐药性是医疗行业和养殖业比较头痛的问题，虽然随着科技的进步尤其是分子生物学技术的发展，许多新药以越来越快的速度被开发出来，但事实表明，新药的开发速度远远低于细菌产生抗药性的速度，因而目前出现的现象就是新药使用越来越多，而细菌耐药性的产生也越来越快。所以当务之急是寻找和开发细菌不易产生耐药性的药物.抗菌肽就是其中的一个亮点，研究表明，细菌对抗菌肽不易产生抗药性，抗菌肽对很多耐药性菌株都非常有效，因此将抗菌肽开发为抗菌药物成为当今研究的热门课题。
　　 目前已知的抗菌肽大部分是天然分离或人工合成的，含量少且成本高，这对于抗菌肽发展成为临床应用产品是极不现实的。而且天然的抗菌肽杀菌活较低，有的对哺乳动物细胞还有一定的毒性。许多学者已经进行了大量的研究来提高抗菌肽的活性并降低其毒性。本研究将几种富含不同氧基酸的抗菌肽串连表达，以期作为复合抗菌肽研究其生物学活性，试验内容及结果如下：
　　 1选取Genbank中的Protegrin-1、4kD Scorpion Defensin、Metalnikowin-ⅡA、SMAP-29、Thanatin和Moronecidin抗菌肽序列，它们富含不同的氨基酸，S MAP-29、Thanatin、Protegrin-1、4 kda Scorpion Defensin富含精氨酸或赖氨酸，Metalnikowin-ⅡA则富含脯氨酸、Moronecidin则富含组氨酸。将上述抗菌肽核苷酸序列用酵母的Kex2酶裂解位点识别序列（gagaaaaga）串联起来，并根据酵母偏好密码子对其进行改造，设计成复合抗菌肽cp基因，克隆到酵母表达载体pPICZa-A中，转化入巴斯德毕赤酵母受体菌X-33中诱导表达.Tricine-SDS-PAGE检测表明抗菌肽获得了表达，表达量为271μg/mL.体外抑菌试验检测表明表达的复合抗菌肽CP可以耐受至少30分钟的高温，在pH6～8时最稳定，酸对其活性影响较碱小，对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度为1.624μg/mL，135.5μg/mL的复合抗菌肽对小鼠红细胞的溶血率为3.47％。
　　 2为了研究复合抗菌肽CP的抗菌活性及毒性，又从六种抗菌肽中选取MetalnikowinⅡ A（MET）和Scorpion Defensin（SD）分别在酵母中表达。参照酵母偏爱密码子表，推导两种抗菌肽的核苷酸序列，并对它们的C端进行改造，分别用TD-PCR和PCR法获得目的基因，在巴斯德毕赤酵母中进行表达。结果表明，成功表达了上述两种抗菌肽，表达量分别为223μg/mL和131μg/mL。复合抗菌肽CP与它们相比活性比它们高3～7倍，而在热稳定性和酸碱稳定性上CP和MET相似，都可以耐受至少30分钟的高温，在pH6～8时最稳定，酸碱对它们均有影响，相比之下，碱的影响较大。复合抗菌肽CP的溶血率处于MET和SD两者之间。
　　 3为了研究抗菌肽与抗生素之间的联合药效，为临床减少抗生素的使用提供理论依据，选取几种临床常用的抗生素药物（青霉素、链霉素、卡那霉素，环丙沙星，新霉素、四环素、多粘菌素B、诺氟沙星、头孢菌素），分别测定它们的最小抑菌浓度（MIC），初步探讨3种抗菌肽分别与它们结合后的抗菌活性，并采用分级抑制浓度指数（FIC）来定量检测抗菌肽与抗生素之间的抗菌作用关系。结果发现，抗菌肽和抗生素对不同细菌的抗菌活性不同，三种抗菌肽与不同抗生素之间的抗菌协同关系因细菌种类而不同，三种抗菌肽与卡那霉素、链霉素、四环素及多粘菌素B联用对几种细菌都有不同程度的协同或相加作用，而与青霉素等抗生素则是不相关甚至拮抗关系，说明抗菌肽与抗生素之间并不是都存在协同关系，抗菌肽、抗生素与细菌三者的相互作用关系比较复杂，有待进一步研究。
　　 4为了研究复合抗菌肽CP对ICR小鼠生长和免疫机能的影响，将180只ICR小鼠随机分为复合抗菌肽CP高、中、低剂量组，PBS对照组，空载体对照组及抗生素环丙沙星对照组。试验期35天，各组小鼠给药途径均为口服。期间观察小鼠体重、采食量，第0、7、14、21、28、35天称重，各组随机取3只，眼球采血致死，称脾和胸腺重，取血清测定细胞因子IL-2、IL-4及IFN-γ的含量。结果发现，各组全期平均日增重分别为0.644、0.638、0.62、0.63、0.632、0.614g/只，CP低、中剂量组增重高于PBS对照组，但差异不显著（P>0.05），与其他各组相比差异也不显著（P>0.05）；各组的料重比分别为7.66:1，7.52:1、8.71:1、7.84:1、7.87:1、8.16:1，低、中剂量抗菌肽组与PBS对照组相比，料重比明显降低，差异极显著（P<0.01）。低中剂量复合抗菌肽CP组的胸腺和脾脏指数都呈增高趋势，淋巴细胞增殖试验表明，抗菌肽各剂量组都高于PBS对照组，差异均极显著（P<0.01），与空载体对照组相比，低剂量组差异极显著（P<0.01）。抗菌肽低中剂量组IFN-γ和IL-2值与PBS对照组相比均有升高，而IL-4有所下降，三个剂量组抗菌肽都可以部分提供细菌感染保护作用，低剂量组保护率最高。结果表明，合适剂量的抗菌肽可以提高饲料转化率，促进小鼠淋巴细胞增殖，保护小鼠抗细菌感染。
　　 5研究复合抗菌肽CP对ICR小鼠肠道菌群及肠道吸收能力的影响，提供抗菌肽的临床应用安全依据。将180只ICR小鼠分为复合抗菌肽CP高、中、低剂量组，同时设PBS对照组，空载体对照组和环丙沙星对照组。每隔一周采集小鼠十二指肠、空肠段于固定于4％甲醛溶液中，制作组织切片检测鸡十二指肠和空肠的绒毛长度和隐窝深度，计算绒毛长度和隐窝深度比值（V/C），并于第35天取直肠内容物分离细菌。结果显示，抗菌肽试验组各种肠道菌的数量均低于对照组，且随剂量增加数量越少；试验第0天，各组小鼠十二指肠绒毛、隐窝深度及V/C值基本相同，差异不显著（P>0.05）；到第35天，A、B、E组小肠绒毛长度，V/C值高于对照组，差异极显著（P<0.01），隐窝深度低于对照组，差异极显著（P<0.01），C组小肠绒毛长度及V/C值低于对照组，隐窝深度高于对照组，差异极显著（P<0.01）。说明抗菌肽可以影响肠道菌群，但适当剂量可改善小鼠肠道吸收能力，提高小鼠生长速度和饲料转化率。
　　 以上试验证明，将几种抗菌肽串连表达作为抗菌肽混合物利用来提高抗菌肽活性的设计思路是合理的，而且生物学活性显示其可以促进小鼠生长，具有免疫增强剂的功效，为抗菌肽的临床应用提供理论依据和参考。

目录

文摘

英文文摘

英文缩写及名称

氨基酸及其缩写

第一篇 文献综述

第一章 抗菌肽研究概况

1 抗菌肽的发现

2 抗菌肽的特性及分类

3 抗菌肽的生物学功能

4 抗菌肽的作用机制

5 影响抗菌肽活性的因素

6 抗菌肽与耐药性

7 关于抗菌肽的一些数据库

8 抗菌肽的应用及前景

参考文献

第二章 抗菌肽的设计改造及基因工程表达现状

1 抗菌肽的设计与改造

2 抗菌肽的基因工程表达现状

参考文献

第三章 几种抗菌肽的基本特征及本研究的目的意义

1 几种抗菌肽的基本特征

2 本研究的目的和意义

参考文献

第二篇 试验部分

第四章 复合抗菌肽CP的设计表达及基本特性研究

摘要

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

参考文献

第五章 MET和SD在毕赤酵母中的表达及活性比较

摘要

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

参考文献

第六章 抗菌肽与抗生素的体外联合药效研究

摘要

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

参考文献

第七章 复合抗菌肽CP对小鼠生长及免疫机能的影响

摘要

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

参考文献

第八章 复合抗菌肽CP对小鼠肠道菌群及肠道吸收能力的影响

摘要

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

参考文献

全文总结

致谢

攻读博士期间发表论文

附录