三种植物病原细菌的实时荧光定量PCR检测

摘要

萎蔫短小杆菌糖甜菜致病变种(Curtobacterium flaccumfaciens pv．Beticola,cfb)是引起糖甜菜(Beta vulgaris var．saccharifera)叶斑病的主要病原物。依据该病原菌的16S-23S rRNA ITS区(登陆号为AY191513)在特异性位点用Primer Premier 5.0设计了一对引物CfbF(5’-TCAGTGCTGGTCGCCCATFAG-3’)和CfbR(5’-AACAA CGTGCACCAGCCAGC A-3')，预计PCR扩增产物为191 bp。用该引物扩增3个cfb菌株及29个参比菌株，仅靶标菌扩增出191 bp产物；在实时荧光定量PCR检测体系中，靶标菌株都检测到较强的信号，熔解曲线为单峰，没有非特异性扩增。为建立标准曲线将靶标基因组DNA稀释为0.001 ng，0.01 ng，0.1 ng，1 ng，10 ng共5个梯度，进行实时荧光PCR扩增。回归方程为y=-0.2741x+7.51，R<'2>=0.99。 菌株Tc7(Pseudomonas spp．)是从发病糖甜菜上分离到的另一病原细菌，用16S rRNA通用引物(16sF：5’-ATTGAACGCTGGCGGCAGGCCT-3’和16sR：5’-TCC CCTACGGTTACCTTGTTA -3’)扩增其16S rRNA并测序，经比对发现其与Pseudomonas argentinensis、Pseudomonas flavescens、Pseudomonas fulva 等多个菌株的16S rRNA序列同源性都很高，几乎不存在特异性位点。用已报道的真细菌ITS通用引物U1/U2扩增该菌株16S-23S rRNA间的ITS，测得420 bp序列(已登陆至GenBank数据库，登录号为EF205021)，在多态性较为丰富的区域设计引物PF(5’- AGGCGCTCAAGCAAATCATAGA-3’)和PR(5’-TTGTTCCCAATCACGTAGGGTG -3')，预计PCR扩增产物为238 bp。常规PCR验证引物特异性，除靶标菌株外其余29个参比菌株均无扩增产物。在实时荧光定量PCR检测体系中，靶标菌株扩增曲线平滑，熔解曲线主峰明显，表明没有非特异性扩增。将靶标基因组DNA依次稀释10倍，成0.00084 ng，0.0084 ng，0.084 ng，0.84 ng，8.4 ng，84 ng共6个梯度，阴性对照为灭菌超纯水。每个处理做两个重复，制备标准曲线。每两个重复的曲线基本重合，Ct值也十分相近，表明重复性较好。标准曲线的回归方程为y=-3.33x+20.42，R<'2>=0.99。该方法适用于糖甜菜叶片上病原物的检测。 茄青枯茵(Ralstonia solanacearum)能够引起多种重要作物萎蔫症状，是一类重要的的病原菌。本研究用J．Schonfeld等人报道的引物Rsol_fliC建立了对该菌的实时荧光定量PCR(SYBR Green Ⅰ)检测体系，并制作标准曲线，回归方程为y= -3.74x+44.15，R<'2>=0.96。

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第一章文献综述

1.研究目的及意义：

2.细菌鉴定检测方法

2.1传统的细菌分类、鉴定和检测方法

2.2数值分类法(Numerical taxonomy)

2.3化学分类法

2.4血清学

2.5分子生物学和遗传学方法

3.细菌的定量方法

3.1.传统的细菌计数方法：

3.2. PCR定量法：

第二章研究内容

1材料与方法

1.1参试菌株

1.2试剂及培养基

1.3通用引物扩增

1.4 PCR产物的回收、克隆和测序

1.5引物设计

1.6特异性引物的常规PCR扩增及电泳

1.7实时荧光定量PCR的扩增

2.结果与分析

2.1特异性引物的设计

2.2引物的特异性验证

2.3实时荧光PCR检测

2.4标准曲线的制备

2.5实时荧光PCR的灵敏度检测

2.6糖甜菜叶片中Tc7的实时荧光PCR检测

3.结论及讨论

参考文献

致谢