播娘蒿胰蛋白酶抑制剂基因转化油菜的研究

摘要

植物蛋白酶抑制剂基因具有广谱抗虫性、安全,无毒副作用等优点,研究蛋白酶抑制剂基因具有重要意义。本研究利用农杆菌介导法将2个播娘蒿胰蛋白酶抑制剂(DSTI)基因导入甘蓝型油菜中,研究其功能,主要结果如下： 构建植物表达载体pCAMBI1301-DsTI1和pCAMBI1301-DsTI2,经酶切验证后,转入农杆菌菌株LBA4404中。建立了甘蓝型油菜品系NJ5424子叶节的遗传转化体系,将油菜子叶节在附加4mg/L 6-BA的培养上进行预培养,在含有3.0mg/L 6-BA、0.1mg/LNAA和12.5mg/L潮霉素(Hyg)的选择培养中筛选。再生芽在含有2.0mg/L 6-BA、0.1mg/L NAA和12.5mg/L Hyg的培养基中进行分化培养。DsTI1和DsTI2转化甘蓝型油菜品系NJ5424共获得41株潮霉素抗性植株,经过PCR鉴定共计获得17株阳性植株。 对2个基因的T1代转基因油菜进行PCR检测,结果表明T1代转基因油菜植株呈现3:1分离,表明目的基因以单拷贝插入油菜基因组中,并且能够在转基因油菜后代中稳定遗传。RT-PCR实验表明外源基因DsTI1、DsTI2在转基因油菜中可正常表达。酶活性测定结果表明,DsTI1和DsTI2转基因油菜对胰蛋白酶和糜蛋白酶的抑制能力远高于野生型,说明播娘蒿胰蛋白酶抑制剂基因具有丝氨酸蛋白酶抑制剂功能。 室内抗虫性实验表明,喂食转基因油菜叶片的菜青虫幼虫的生长发育缓慢,死亡率升高；转基因油菜具有抗虫性。田间虫害调查结果显示虫害级别低于野生型,但差异不显著,这可能与今年虫害情况有关。 T1代农艺性状抽样调查结果表明,DsTI1和DsTI2转基因油菜植株与野生型植株多数性状不存在显著差异,仅有部分性状存在显著差异。例如,在DsTI1-2家系中,存在差异的性状是结果密度；在DsTI1-4家系中,转基因油菜与野生型植株的每果粒数存在差异。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：符号及缩略语

声明

第一章文献综述

1作物抗虫基因工程研究概况

2蛋白酶抑制剂基因研究进展

3十字花科蛋白酶抑制剂基因研究进展

4油菜遗传转化方法的研究进展

5本研究的目的和意义

第二章播娘蒿胰蛋白酶抑制剂基因的载体构建

1材料和方法

2结果

3讨论

第三章 DsTI转基因油菜植株的获得

1材料和方法

2结果

3讨论

第四章 DsTI在转基因油菜中的功能初步分析

1材料和方法

2结果

3讨论

第五章转基因油菜的农艺性状和抗虫性初步分析

1材料和方法

2结果

3讨论

全文结论

参考文献

附录 pCAMBIA1301的质粒图谱

攻读硕士期间发表或待发表的研究论文

致谢