水稻黄单胞菌感知的水稻信号分子的分离及hcm1转基因烟草的研究

摘要

水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)和水稻条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola,Xooc)是水稻黄单胞菌(Xanthomonas oryzae,Xo)种下的两个致病变种,分别引起的水稻白叶枯病(bacterial blight,BB)和水稻细菌性条斑病(bacterial leaf streak,BLS)在生产上造成较大危害。Xoo和Xooc均拥有决定在非寄主植物上激发过敏反应和在寄主植物上产生致病性的hrp(hypersensitiveresponse on nonhost plants and pathogenicity on host plants)基因簇。 通过改良Xcv(Xanthomonas campestris pv.vesicatoria)hrp基因的诱导培养基XVM2,本实验室获得了适合Xoo与Xooc hrp基因诱导表达的基本培养基XOM3。用N6液体培养基振荡培养,本研究有效建立起水稻的悬浮细胞系。为研究hrp基因的功能,本研究将Xooc的hrpX和hpa1基因启动子与绿色荧光蛋白基因gfp(green fluorescenceprotein)构建为融合基因。荧光显微检测表明,Xo的hrp基因在营养丰富的NB培养基上不能有效表达,在hrp诱导培养基XOM3上可有效表达；与水稻悬浮细胞,水稻愈伤细胞互作,Xo的hrp基因被高效诱导表达。这些结果表明,Xo的hrp基因是诱导表达的,本研究已成功建立起Xo的hrp基因诱导表达系统。Xo hrp诱导表达系统的建立为研究hrp基因的功能,发掘T3SS(type III secretion system)效应分子以及开展Xoo和Xooc致病性比较遗传学研究奠定了基础。 为研究不同遗传背景下Xooc hpa1和hrpX基因的表达情况,本研究将hrpX∷gfp、hpa1∷gfp融合基因导入Xooc的hrpX、hpa1、hrpF,hrcV突变体中。绿色荧光蛋白表达揭示,在诱导表达条件下,hpa1、hrpF、hrcV基因突变体中hpa1和hrpX基因的表达水平与野生型相当,表明hpa1、hrpF、hrcV基因突变不影响hpa1和hrpX基因的表达；而在诱导表达条件下hrpX突变体中,hpa1基因不能被诱导表达,hrpX基因仍能维持野生型背景下的表达水平,表明hpa1基因的表达受HrpX蛋白的调控,hrpX基因的表达不受自身的调控,在hrpX基因的上游还存在别的调控因子。 为研究Xooc的Harpin和Avr蛋白的泌出特性,本研究构建了harpin∷gfp、avr/pth13∷gfp的融合蛋白基因,使其在诱导条件下表达。荧光显微检测结果表明,与水稻细胞共培养16h导入融合蛋白基因的RS105菌株在诱导条件下菌体不发荧光,且也没有观察到水稻细胞部位有荧光；导入融合蛋白基因的RS105菌株hrcV基因突变体在诱导条件下菌体可见荧光,与水稻悬浮细胞互作也未见水稻细胞部位有荧光,揭示Harpin∷GFP、Avr/pth13∷GFP融合蛋白通过T3SS才能泌出至水稻细胞中。由于GFP的瞬时表达特性,在荧光激发光下难以观察到水稻细胞部位有融合蛋白结合。以Xooc的RS105/pXG为供试菌株,本研究试图从水稻悬浮细胞中分离能诱导hrp基因表达的水稻信号分子。RS105/pXG与水稻悬浮细胞互作16h,在悬浮培养液中游离的菌体hrp基因也能被诱导表达。根据这一结果,本研究在RS105与水稻悬浮细胞互作16h后的共培养液的基础上获得了RCM2,荧光检测发现RCM2能诱导hrpX基因的表达,表明其中含有能诱导hrp基因表达的信号分子。通过超滤离心,发现诱导信号分子存在于分子量小于5000D的溶液中。紫外-可见光(190nm-780nm)扫描结果表明,RCM2最大吸收峰在190-238nm处,在360-780nm处基本没有吸收。进一步的研究发现,诱导信号分子是亲水性的物质,不能被乙酸乙酯、氯仿、等萃取,也不能被80％甲醇、乙醇沉淀,对蛋白酶K不敏感,100℃20min信号分子不会失活。薄层层析结果揭示,RCM1与RCM2中主要物质成分均为为糖类,两者比较主要是所含糖类的种类和含量不同。 HarpinXooc蛋白可在植物上激发HR(hypersensitive response)与诱导产生多种有益表型,如抗病、抗虫、抗旱以及促进植物生长等,但它没有直接的杀菌活性。将HarpinXooc和Cecropin以及Melittin的活性结构域通过polylinker与自由环进行分子组合,重组表达后的Hcml(Hpal-Cecropin-Melittin)融合蛋白在植物上可激发过敏反应和诱导产生SAR(system acquired resistance),对革兰氏阴性植物病原细菌和植物病原真菌具有杀菌功能。为研究Hcm1蛋白在植物体内表达后是否也能赋予植物产生SAR,本研究通过土壤杆菌介导法将含hcm1基因的pBI121重组载体导入基因工程模式植物烟草中。在含Km(100mg/L)的MS固体培养基上筛选到具有抗性的烟草转化植株,初步认为是转化成功的植株。PCR和Southern杂交证明融合基因已经整合到植物染色体上,RT-PCR结果证明转化成功的植株中hcm1基因能够正常转录表达。 Hcm1融合蛋白含有Hpa1蛋白完整的功能域,能在植物上激发HR反应和诱导植物产生SAR,本研究通过RT-PCR检测植物防卫反应途径与HR反应标志基因的转录表达情况。结果表明,Hcm1融合蛋白在烟草中表达后,HR反应标志基因hin1与hsr203j的转录被激活,植物防卫反应途径下游PR1α基因的表达也被激活,而相应转空载体的植株检测不到这些基因的转录表达。TMV抗性测定结果表明,表达Hcm1融合蛋白的烟草对TMV的抗性显著增强；喷雾接种烟草野火病菌,结果发现转基因烟草的病斑数明显较转空载体植株少。这些结果表明Hcm1蛋白通过激活植物抗病反应途径赋予了转基因烟草广谱的抗病活性。

目录

文摘

英文文摘

声明

引言

文献综述

第一章植物病原细菌hrp基因的表达与调控

第一节基本培养基中hrp基因表达的影响因子及hrp诱导培养基

第二节植物信号分子对植物病原细菌hrp基因表达的诱导

第三节植物病原细菌hrp基因的调控系统

第二章植物基因工程研究进展

1植物基因工程发展概况及再农业生产上的应用

2植物遗传转化方法

3转基因植株的筛选与检测

第三章植物病原细菌Harpin蛋白及其利用

1Harpin蛋白的种类及其结构

2Hatpin蛋白的作用机理

3Harpin蛋白的利用途径及存在问题

研究内容

第一章水稻黄单胞菌hrp基因诱导表达系统的建立

1材料与方法

2结果与分析

3.结论与讨论

第二章诱导XO hrp基因表达的水稻信号分子的分离与鉴定

1.材料与方法

2.结果与分析

3.结论与讨论

第三章hcm1转基因烟草的遗传转化、筛选和检测

1.材料和方法

2.结果与分析

3.结论与讨论

第四章hcm1转基因烟草植株的表性测定

1.材料与方法

2.结果与分析

3.结论与讨论

参考文献

全文结论

攻读硕士学位期间发表的文章

致谢