大豆突变体库的构建及子叶折叠突变相关基因的初步研究

摘要

大豆[Gtycinemax(L.)Merr.]是世界上最重要的经济作物之一，由于基因组结构复杂、遗传转化效率低等原因限制了其功能基因组研究的发展。但随着大豆基因组测序的初步完成，大豆功能基因组研究将成为研究的重点。突变体是基因功能研究的重要材料，也是大豆遗传改良的基础材料，鉴于此，本研究利用叠氮化钠，60Coγ射线，甲基磺酸乙酯等方法处理大豆品种“南农86-4”，“南农87c-38”和“南农94-16”，以初步构建大豆突变体库，并对其中一个子叶突变体开展了较系统的研究。主要结果如下： 1、大豆突变体库的构建 对3个品种的M2、M3世代的突变体进行了表型性状调查和分析，都获得包括叶、茎、花、种子等性状变异的材料，其中“南农86-4”叶变异120份、茎变异24份、花变异26份、种子变异9份、熟期及育性变异6份，共185份；“南农87c-38”叶变异10份、茎变异4份、花变异3份、种子变异3份、熟期及育性变异42份，共62份；“南农94-16”叶变异84份、茎变异3份、花变异10份、种子变异21份、熟期及育性变异2份，共120份.对部分突变体的蛋白质及油分含量进行了分析，发现“南农86-4”突变系蛋白质含量范围为：39.5％～52.5％，油分含量范围为：15.3％～22.9％，“南农94-16”突变系蛋白质含量范围为：39.1％～48.1％，油分含量范围为：17.3％～22.2％。 2、大豆子叶突变体的鉴定与分析 1)农艺品质性状 对通过NaN3-60Coγ射线诱变“南农94-16”获得的子叶折叠突变体进行农艺性状综合调查，发现该突变体表现为子叶向外折叠，种皮部分皱缩，比对照品种晚熟9天左右，而其它表型无明显差异。子叶形态观察结果表明，突变体子叶折叠形态是在种子发育初期由于子叶伸展受到抑制形成.蛋白质测定表明，突变体蛋白质含量比对照高3个百分点。氨基酸组份分析表明，与对照相比，突变体的17种氨基酸中除丝氨酸含量没有明显变化，脯氨酸、苏氨酸、酪氨酸含量有一定的降低外，其它13种氨基酸含量都增加，尤其是蛋氨酸含量增加33％以上，游离氨基酸测定结果表明，突变体比对照含量高74％以上. 2)遗传分析 通过杂交对子叶折叠突变体进行遗传分析，F2结果分析表明，该性状由两对隐性细胞核基因控制. 3)基因组水平分析 为了总体了解子叶折叠突变体与对照在基因组水平上的差异，本研究对突变体及对照的基因组DNA进行了SSR标记分析。筛选大豆SSR标记共957对，结果显示有9对标记表现差异，这些标记集中分布在三个连锁群B1、D2、G的三个位点上。据前人研究结果分析，B1连锁群上的标记Satt426附近有蛋白质与油分的QTL；G连锁群上的Satt163、Satt038、Sat_168、Satt570、AW734137标记附近有种子性状的QTL. 为了发现突变体与对照在基因组水平上的差异，本研究运用比较基因组杂交芯片(AffymetrixRGeneChip)进行分析，对数据结果以信号值相差1.2倍为标准进行筛选，获得明显差异的19个候选基因，其中突变体比对照杂交信号值增强的有10个基因，突变体比对照杂交信号值减弱的有9个基因，参考其它作物的研究结果，对这些基因进行了初步的功能预测，突变体比对照杂交信号增强的10个基因中有7个基因编码的蛋白为未知蛋白，3个基因编码的蛋白预测为已知蛋白。3个已知蛋白的功能分别为：天冬氨酸-tRNA连接酶，UDP-葡糖基转移酶，EF-hand钙结合蛋白CCD1。突变体比对照杂交信号减弱的9个基因中有3个基因编码的蛋白为未知蛋白，6个基因编码的蛋白预测为已知蛋白。6个已知蛋白的功能分别为：亮氨酸氨基肽酶，翻译起始因子，核糖体蛋白，Dof锌指蛋白，丙酮酸脱氢酶，细胞色素P450单氧酶。为了从中发现可能与子叶形态密切相关的基因，我们用RT-PCR对19个候选基因在开花后30天的种子中进行了差异表达研究。其中突变体比对照杂交信号值增强的10个基因中，Gma.15488的表达结果与CGH芯片结果一致，但Gma.15488编码的蛋白为未知蛋白，突变体比对照杂交信号值减弱的9个基因中，TC208897的表达结果与CGH芯片结果一致，TC208897编码的蛋白为Dof锌指蛋白。19个基因中除了这两个基因外，其它基因或者全部没有表达，或者表达水平一致，说明这两个在子叶中差异表达的基因最有可能与子叶的异常发育相关，但需要进一步验证。 4)子叶突变对大豆种子蛋白组成的影响 为了研究子叶折叠性状可能对种子贮藏蛋白组成的影响，本研究运用双向电泳技术对由三种不同处理方式获得的表型相似的子叶折叠突变体进行比较研究，获得3个共同的差异蛋白质，其中两个均为球蛋白亚基G3/AlaBlb，在突变体中含量增加；另一个为大豆凝集素，在突变体中含量降低。 3、大豆TILLING技术的建立与初步应用 本研究还对新发展的基因功能研究方法TILLING技术进行了优化，将粗提取的CELI酶初步运用于大豆TILLING技术中，在75份与大豆叶形性状相关的突变体材料中检测KNOX基因，结果显示一个突变体在该基因内发生单碱基变化，但编码的蛋白没有变化。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：本研究中提及的缩略词及其英汉对照

声明

第一部分 文献综述

第一章 植物理化诱变研究进展

1理化诱变方式及诱变机制

2理化诱变育种的研究进展

3理化诱变构建突变体库的研究进展

4植物理化诱变前景展望

第二章 大豆功能基因组研究进展

1种子性状遗传学研究

2比较基因组杂交芯片研究进展

3蛋白质组研究进展

4 TILLING技术研究进展

本研究的目的意义

第二部分 研究报告

第三章 大豆突变体库的构建

1材料与方法

2结果与分析

3讨论

第四章 子叶折叠突变相关基因的研究

第一节 子叶折叠突变体农艺性状、品质性状研究及遗传分析

第二节 子叶折叠突变体SSR标记研究

第三节 子叶折叠突变体的比较基因组杂交研究

第四节 子叶折叠突变对种子蛋白组成的影响

第五章 大豆TILLING技术的建立及初步应用

第一节 CELⅠ酶的粗提取及其活性检测

第二节 TILLING技术的初步应用

全文结论

本研究创新之处

参考文献

附 录

附 图

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致 谢