水稻叶扭曲基因CL的精细定位与“培矮64S/93-11”染色体片段置换系分子标记的完善

摘要

从水稻(Oryza. sativa L.)四倍体花药培养的二倍体后代植株中获得了稳定遗传的叶扭曲突变体cl，克隆控制该性状的基因CL对水稻叶片发育机制的阐明有着重要的意义.本研究首先对cl进行了形态观察和遗传分析，接着对CL进行了精细定位，并获得了候选基因，为最终阐明该基因的功能奠定了基础。 形态观察发现：从发芽到分蘖期，突变体和它的野生型姊妹系对照在株叶形态上没有明显区别.分蘖期后，与对照相比，突变体的植株明显矮化，倒数第一、第二、第三叶基部及叶枕部位扭曲；主茎不抽穗或抽出短小的穗；分蘖数明显增多；出现了二次分蘖；结实率明显降低。 遗传分析表明cl是单基因隐性突变体。利用SSR标记和cl与珍汕97B杂交组合F2中具有突变体表型的140个单株对突变基因进行了初步定位，位于水稻笫3染色体上SSR标记RM60和RM22之间，遗传距离分别为8.2和1.4 cM。随后通过扩大定位群体，并根据水稻基因组序列开发了新的InDel和SSR标记，构建了cl目标基因区域的高密度遗传图谱和BAC重叠群，将突变基因精细定位于BAC098695上大约23kb区间内。基因分析软件预测到23kb的定位区间内仅有2个开放阅读框：一个编码Fizzy相关蛋白，另一个编码RNA结合蛋白.通过PCR从叶正常材料和突变体中扩增出了2个开放阅读框的基因组DNA，测序结果显示：编码RNA结合蛋白的基因，突变体与叶正常材料间的DNA序列没有差异；编码Fizzy相关蛋白基因，叶正常材料的DNA序列都一致，比较突变体和正常材料中的DNA序列，发现有一个碱基的缺失(38-胞嘧啶)和一个碱基由胞嘧啶(40-C)替换成了鸟嘌呤(40-G)，造成了CL编码的提前终止.推测编码Fizzy相关蛋白基因为CL的候选基因。 通过RT-PCR从日本晴中扩增出CL的全长cDNA，通过测序确定了CL的序列组成，其由10个外显子和9个内含子组成.为了验证候选基因，我们把包含有1.2kb的启动子区和终止密码子后1.1kb总长为6.2kb的CL全基因序列和表达载体pCambia1305.1重组构建了互补载体，目前正在利用重组质粒进行遗传转化， 染色体片段置换系是指一套以相同亲本为遗传背景，置换了供体亲本一个或少数染色体片段的系列株系所组成的群体，广泛用于杂种优势、复杂数量性状的QTL定位、基因克隆等研究，有的株系甚至是极有价值的遗传育种中间材料。我们实验室通过回交和分子标记辅助选择，已经初步构建了以“93-11”为遗传背景，以“培矮64S”为供体亲本的一套置换系群体.但是亲本间分子标记的多态性相对较低，在染色体的部分区段尚缺乏多态的分子标记.由于供体片断在置换系群体的存在与否是通过分子标记来鉴别的，部分区段缺乏标记将无法确定该区段染色体是否发生了置换，削弱了该片段置换系群体在遗传和育种上的利用价值。在与北京华大基因组研究中心合作的基础上，我们利用培矮64S序列信息，在标记多态性低的染色体区段开发了新的标记，并对原群体进行了基因型分析，这些结果将有利于完善该片段置换系群体。 主要结论如下： 1在分子标记多态性低的染色体区段开发了202对SSR和InDel标记，其中87对在双亲间呈现出多态性。多态性比例为43.3％.将上述多态性标记与以前的多态性标记整合后，选择在12条染色体上分布相对均匀的204个标记重新构建了分子标记连锁图，该图谱覆盖全基因组1402.5 cM，标记间平均间距由原来的13.08 cM变为6.88 cM，极大地提高了分子标记的密度。 2利用上述开发的87个新的标记对构成“培矮64S/93-11”染色体片断置换系的131个候选单株进行了基因型分析，结果如下：1)检测到了150个新的置换片段。2)第3号染色体48.1-68cM处、第4染色体33.1-48.4cM处和第5染色体101.8-108.6cM处没有检测到置换片断.3)所有株系置换标记数平均增加为1.3个，其中有110个株系增加的置换标记小于5个，其它21个株系增加的置换标记大于6个。

目录

论文说明：英文缩略表

声明

第一篇水稻叶扭曲基因CL的精细定位

摘要

第一章 文献综述

1.1 SAM：产生一簇能形成叶原基“基细胞”的机器

1.2叶起始位点的选择

1.3叶原基形成的分子机制

1.4分化和确定：控制叶有限发育模式的基因相互作用网络

1.5叶极性的建立

1.6控制叶片形态(表面曲度)的基因

1.7水稻基因的图位克隆技术

1.8本研究目的和意义

第二章水稻叶扭曲基因CL的精细定位

2.1 材料

2.2方法

2.3结果与分析

第三章 本部分的结论

3.1 叶扭曲突变体的发现和遗传分析

3.2 叶扭曲相关基因CL的精细定位结果

3.3 叶扭曲相关基因CL的候选基因鉴定

3.4 叶片扭曲相关基因CL可能与叶细胞的细胞周期有关

参考文献

第二篇“培矮64S／93-11”染色体片段置换系分子标记的完善

摘要

第四章文献综述 染色体片段置换系在作物性状研究中的应用

4.1 染色体片段置换系的特点及应用优势

4.2染色体置换系构建的研究进展

4.3染色体置换系的构建方法

4.4染色体片段置换系的应用及展望

第五章 “培矮64S／93-11”染色体片段置换系分子标记的完善

5.1 实验材料

5.2实验方法

5.3结果与分析

第六章 第二编结论

参考文献

附录

致谢