白头翁汤及其主要成分抗大肠杆菌内毒素的作用机理研究

摘要

大肠杆菌病是一种急性传染病，该病传播迅速，病死率高，造成巨大的经济损失，制约着畜牧产业的健康发展。当前临床治疗手段多采用抗菌药物或高免血清，但长期应用抗生素容易产生耐药性和兽药残留，对动物和人类的健康均会造成严重的危害；高免血清因为成本较高、产量较低，从而限制了其的广泛应用。中药白头翁汤用于防治感染性疾病在人医和兽医临床都有广泛实践，并以确切的疗效和较低的毒副残留及抗药性而广受欢迎。本研究测定了白头翁汤抗大肠杆菌内毒素(LPS)的作用和对LPS诱导大鼠肠黏膜微血管内皮细胞(MVEC)基因表达谱的影响，以及白头翁汤及其主要成分对LPS诱导MVEC分泌NO、ET-1、 IL-1α、IL-6、IL-8、TNF-α、E-selectin、TXB2和6-keto-PGF1α的影响，旨在探讨白头翁汤的抗内毒素作用和抗炎机制，为临床应用白头翁汤防治细菌内毒素性疾病提供理论依据。具体研究内容分为以下八部分：
　　 实验Ⅰ白头翁汤抗大肠杆菌内毒素的作用观察取中药饮片按常规方法煎制成生药浓度为1g/mL的白头翁汤药液，分高、中、低三个剂量给小鼠灌胃，每天1次，连续5天。第一次给药前3h和最后一次给药后3h分别腹腔注射LPS。记录LPS攻毒后48h内小鼠的死亡率，同时测定各组小鼠的体温、体重、血像及器官指数。结果，治疗高剂量组、预防高剂量和中剂量组的小鼠死亡率显著低于LPS对照组。治疗各剂量组和预防各剂量组的小鼠体温在6h和12h时均显著或极显著高于LPS对照组.治疗高剂量组和预防高剂量组的小鼠体重在24h时显著高于LPS对照组。治疗高剂量组的小鼠白细胞数目、血红蛋白浓度、平均血红蛋白量和血小板数量较LPS对照组均显著升高。治疗高剂量组小鼠的肝脏、脾脏和肠管指数显著低于LPS对照组。表明白头翁汤具有明显的抗大肠杆菌内毒素作用.
　　 实验Ⅱ大鼠肠黏膜微血管内皮细胞的培养与鉴定从1日龄SD大鼠的空肠段分离肠黏膜，用胰蛋白酶消化法分离微血管内皮细胞(microvascular endothelial cell,MVEC)，培养，用差速消化法和差速贴壁法，进一步纯化、传代。用形态学观察法、第Ⅷ因子相关抗原免疫荧光法和硝酸银染色法进行综合鉴定。结果证实，大鼠肠黏膜MVEC培养成功，操作方法简单、重复性好，培养的细胞纯度理想、性质稳定。为下一步研究LPS和PD对MVEC分泌功能的影响提供了实验材料。
　　 实验Ⅲ白头翁汤对LPS诱导MVEC基因表达谱的影响将MVEC培养至单层融合状态，先后加入LPS和白头翁汤作用12h后，提取三个处理组的总RNA。采用基因芯片检测，读取各组基因表达的变化情况并进行生物学分析。结果，LPS组比空白组产生69个差异表达基因，LPS-PD组比LPS组产生578个差异表达基因，LPS-PD组比空白组产生122个差异表达基因。分析各组差异基因发现，白头翁汤通过减少炎症因子的翻译，抑制凋亡基因的转录，加速机体蛋白的合成，增强细胞能量的代谢等方面来对抗LPS所产生的各项毒理效应。
　　 实验Ⅳ LPS诱导的MVEC差异表达基因的Real-time RT-PCR分析在基因芯片实验样品中选取5个与炎症反应相关的差异表达基因，采用Primer5.0软件在所选基因的上下游各设计一条引物，用嵌合荧光法进行Real-time RT-PCR反应。5个目标基因Il1a、I16、Edn1、Tnfsfl1和Ptges的Real-time RT-PCR检测结果依次为9.78、1.76、1.43,2.98和2.12，对应的基因芯片检测结果分别是10.57、1.53、1.59、3.16和1.71，两者的变化趋势高度一致.表明，基因芯片的结果准确可靠，进一步证实了白头翁汤抗LPS的药理作用。
　　 实验V白头翁汤及其主要成分对LPS诱导MVEC分泌NO和ET-1的影响培养MVEC至单层融合状态，加入LPS刺激，3h后加入高、中、低3种浓度的白头翁汤及其主要成分，继续培养21h后收集细胞上清液，测定NO和ET-1的含量。结果，白头翁汤高剂量组和中剂量组、白头翁素高剂量组和中剂量组、小檗碱高剂量组和中剂量组、秦皮乙素高剂量组的NO含量显著低于LPS对照组；白头翁汤中剂量组、白头翁素高剂量组和中剂量组、秦皮乙素高剂量组和中剂量组的ET-1含量显著低于LPS对照组。表明，白头翁汤可在由NO和ET-1介导的机体腹泻、水肿等血管性疾病中发挥治疗作用。
　　 实验Ⅵ白头翁汤及其主要成分对LPS诱导MVEC分泌IL-1α,IL-6和IL-8的影响培养MVEC至单层融合状态，加入LPS刺激，3h后加入高、中、低3种浓度的白头翁汤及其主要成分，继续培养21h后收集细胞上清液，测定IL-1α，IL-6和IL-8的含量。结果，白头翁汤高剂量组、白头翁皂苷B4高剂量组和中剂量组、小檗碱高剂量组和中剂量组、巴马汀高剂量组的IL-1α含量显著低于LPS对照组；白头翁汤高剂量组和中剂量组、白头翁素高剂量组、秦皮甲素高剂量组和中剂量组、秦皮乙素高剂量组的IL-6含量显著低于LPS对照组；白头翁汤高剂量组、秦皮甲素高剂量组和中剂量组、秦皮乙素高剂量组和中剂量组的IL-8含量显著低于LPS对照组。表明，白头翁汤可在由IL-1α，IL-6和IL-8介导的机体全身炎症反应综合症、多器官功能障碍综合征等免疫性疾病中发挥治疗作用。
　　 实验Ⅶ白头翁汤及其主要成分对LPS诱导MVEC分泌TNF-α和E-selectin的影响培养MVEC至单层融合状态，加入LPS刺激，3h后加入高、中、低3种浓度的白头翁汤及其主要成分，继续培养21h后收集细胞上清液，测定TNF-α和E-selectin的含量。结果，白头翁汤高剂量组和中剂量组、白头翁皂苷B4高剂量组和中剂量组、小檗碱高剂量组和中剂量组、药根碱中剂量组、秦皮甲素高剂量组的TNF-α含量显著低于LPS对照组；白头翁汤高剂量组、白头翁皂苷B4高剂量组、小檗碱高剂量组、药根碱高剂量组和中剂量组的E-selectin含量显著低于LPS对照组。表明，白头翁汤可在由TNF-α和E-selectin介导的机体发热、炎症等感染性疾病中发挥治疗作用。
　　 实验Ⅷ白头翁汤及其主要成分对LPS诱导MVEC分泌TXB2和6-keto-PGF1α的影响培养MVEC至单层融合状态，加入LPS刺激，3h后加入高、中、低3种浓度的白头翁汤及其主要成分，继续培养21h后收集细胞上清液，测定TXB2和6-keto-PGFiα的含量。结果，白头翁汤高剂量组和中剂量组、白头翁素高剂量组、小檗碱中剂量组、药根碱高剂量组和中剂量组、巴马汀高剂量组和中剂量组的TXB2含量显著低于LPS对照组；秦皮乙素高剂量组的6-keto-PGF1α含量显著低于LPS对照组。表明，白头翁汤可在由TXB2和6-keto-PGF1α介导的机体弥散性血管内凝血、休克等血栓性疾病中发挥治疗作用。

目录

文摘

英文文摘

符号及缩略语

前言

第一章 文献综述

1 大肠杆菌内毒素的研究进展

1.1 LPS的结构特点

1.2 LPS的感染途径

1.3 LPS引发的效应

1.4 LPS的作用机理

2 白头翁汤的研究进展

2.1 白头翁汤及其主要成分

2.2 白头翁及其主要成分

2.3 黄连及其主要成分

2.4 黄柏及其主要成分

2.5 秦皮及其主要成分

3 微血管内皮细胞的研究进展

3.1 MVEC与病理学的关系

3.2 MVEC与免疫学的关系

3.3 MVEC与中医学的关系

4 几种细胞因子的研究进展

4.1 一氧化氮

4.2 内皮素-1

4.3 肿瘤坏死因子-α

4.4 白介素-1α

4.5 白介素-6

4.6 白介素-8

4.7 E-选择素

4.8 血栓素B2

4.9 前列腺素I2

参考文献

第二章 白头翁汤抗大肠杆菌内毒素的作用观察

1 材料与方法

1.1 白头翁汤的制备

1.2 LPS的制备

1.3 主要仪器

1.4 动物分组

1.5 测定指标

1.6 数据分析

2 结果

2.1 死亡率的变化

2.2 体温的变化

2.3 体重的变化

2.4 血像的变化

2.5 器官指数的变化

3 讨论

3.1 白头翁汤防治LPS引发的高死亡率和体温降低

3.2 白头翁汤防治LPS引发的体重减轻

3.3 白头翁汤防治LPS引发的血像紊乱和内脏病变

3.4 白头翁汤防治大肠杆菌病的疗效

3.5 中药抗LPS的药理作用

参考文献

Observation of anticoliendotoxin action of PD

第三章 大鼠肠黏膜微血管内皮细胞的培养与鉴定

1 材料与方法

1.1 药品与试剂

1.2 主要仪器

1.3 原代培养

1.4 纯化处理

1.5 传代培养

1.6 细胞鉴定

1.7 细胞计数

2 结果

2.1 MVEC的形态学特点

2.2 MVEC的免疫荧光鉴定

2.3 MVEC的硝酸银染色

3 讨论

3.1 MVEC的原代培养

3.2 MVEC的纯化传代

3.3 MVEC的综合鉴定

参考文献

Culture and identification of rat intestinal microvascular endothelial cells

第四章 白头翁汤对LPS诱导MVEC基因表达谱的影响

1 材料与方法

1.1 药品与试剂

1.2 主要仪器

1.3 细胞的分组处理

1.4 总RNA的抽提

1.5 总RNA的质检

1.6 总RNA的纯化

1.7 First Strand cDNA合成

1.8 Second Strand cDNA合成

1.9 Double-Stranded cDNA纯化

1.10 体外转录合成生物素标记cRNA

1.11 cRNA纯化

1.12 cRNA片段化

1.13 芯片杂交

1.14 芯片染色与扫描

1.15 数据分析

2 结果

2.1 总RNA质量检测

2.2 差异表达基因

3 讨论

3.1 LPS对正常的MVEC基因表达的影响

3.2 PD对LPS刺激的MVEC基因表达的影响

3.3 LPS和PD对正常的MVEC基因表达的影响

3.4 基因芯片的质量控制

参考文献

Effects of PD on gene expression of LPS-induced MVEC

第五章 LPS诱导的MVEC差异表达基因的Real-time RT-PCR分析

1 材料与方法

1.1 药品与试剂

1.2 主要仪器

1.3 目标基因的引物序列

1.4 细胞的分组处理

1.5 总RNA的抽提

1.6 总RNA的质检

1.7 总RNA的消化

1.8 总RNA的纯化

1.9 总RNA的消化效果验证

1.10 RNA的逆转录

1.11 Real-time RT-PCR反应

1.12 扩增效率的计算

1.13 变化倍数的计算

2 结果

2.1 RNA质量检测

2.2 目标基因的检测结果

3 讨论

3.1 Real-Time RT-PCR检测的结果

3.2 Real-Tiime RT-PCR方法的选择

3.3 Real-Time RT-PCR操作的改进

参考文献

Real-time RT-PCR analysis of the differently expressed

第六章 白头翁汤及其主要成分对LPS诱导MVEC分泌NO和ET-1的影响

1 材料与方法

1.1 药品与试剂

1.2 主要仪器

1.3 细胞的分组处理

1.4 细胞增殖率的检测

1.5 NO的检测

1.6 ET-1的检测

1.7 数据处理

2 结果

2.1 细胞增殖率的变化

2.2 NO含量的变化

2.3 ET-1含量的变化

3 讨论

3.1 白头翁汤及其主要成分对细胞增殖的影响

3.2 白头翁汤及其主要成分对NO分泌的影响

3.3 白头翁汤及其主要成分对ET-1分泌的影响

参考文献

Effects of PD and its ingredients on LPS-induced MVEC to secrete NO and ET-1

第七章 白头翁汤及其主要成分对LPS诱导MVEC分泌IL-1α，IL-6和IL-8的影响

1 材料与方法

1.1 药品与试剂

1.2 主要仪器

1.3 细胞的分组处理

1.4 IL-1α, IL-6和IL-8的检测

1.5 数据处理

2 结果

2.1 IL-1α含量的变化

2.2 IL-6含量的变化

2.3 IL-8含量的变化

3 讨论

3.1 白头翁汤及其主要成分对IL-1α分泌的影响

3.2 白头翁汤及其主要成分对IL-6分泌的影响

3.3 白头翁汤及其主要成分对IL-8分泌的影响

参考文献

Effects of PD and its ingredients on LPS-induced MVEC to secreteIL-1α,IL-6 and IL-8

第八章 白头翁汤及其主要成分对LPS诱导MVEC分泌TNF-α和E-selectin的影响

1 材料与方法

1.1 药品与试剂

1.2 主要仪器

1.3 细胞的分组处理

1.4 TNF-α和E-selectin的检测

1.5 数据处理

2 结果

2.1 TNF-α含量的变化

2.2 E-selectin含量的变化

3 讨论

3.1 白头翁汤及其主要成分对TNF-α分泌的影响

3.2 白头翁汤及其主要成分对E-selectin分泌的影响

3.3 LPS诱导的炎症反应与毒理效应

参考文献

Effects of PD and its ingredients on LPS-induced MVEC to secrete TNF-α and E-selectin

第九章 白头翁汤及其主要成分对LPS诱导MVEC分泌TXB2和6-keto-PGFiα的影响

1 材料与方法

1.1 药品与试剂

1.2 主要仪器

1.3 细胞的分组处理

1.4 TXB2和6-keto-PGF1α的检测

1.5 数据处理

2 结果

2.1 TXB2含量的变化

2.2 6-keto-PGF1α含量的变化

3 讨论

3.1 白头翁汤及其主要成分对TXB2分泌的影响

3.2 白头翁汤及其主要成分对6-keto-PGF1α分泌的影响

3.3 MVEC的药理学研究意义

参考文献

Effects of PD and its ingredients on LPS-induced MVEC to secrete TXB2 and 6-keto-PGF1α

全文结论

附图

致谢

攻读学位期间发表和完成的学术论文