稻瘟病菌SNARE蛋白的生物信息学分析及Mgsec22的功能研究

摘要

稻瘟病是影响全球水稻产量的重要病害，其病原真菌（Magnaporthe grisea）与水稻的互作系统已成为研究植物病原真菌与寄主互作较为理想的模式系统之一，稻瘟病菌也是研究丝状真菌生长发育和侵染致病机制的重要模式生物。从全基因组水平分析研究稻瘟病菌重要基因的功能，可以加快对稻瘟病菌生物学特征及致病分子机制的认识，为培育长效抗病品种和制定稻瘟病持久控制策略提供了重要的理论依据。
　　 膜泡运输过程在所有的真核生物中是相当保守的，运输小泡与靶膜的融合过程中一类被称为SNARE（可溶性N一乙基顺丁烯二酞亚胺敏感性融合蛋白（NSF）连接蛋白受体蛋白）的整合蛋白是融合事件的关键因子。4个分别来自于不同亚家族Qa-，Qb-，Qc-及R-的SNARE蛋白形成四聚复合体介导膜泡融合过程。本文利用生物信息学手段，根据已经报道的啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）及米曲霉（Aspergillusoryzae）中的SNARE蛋白对稻瘟菌中可能存在的SNARE蛋白进行分析与预测，搜索到21个可能的SNARE蛋白。进一步分析了这些蛋白的二级结构及进化关系，将其分别归类至SNARE蛋白的四大亚家族中，同时对这四类蛋白分别进行蛋白序列比对分析，发现在稻瘟病菌中定位于内质网、高尔基体、内膜的SNARE蛋白是非常保守的。但是与酵母菌不同的是稻瘟病菌质膜上不存在结构相似、功能冗余的Qa-SNARE蛋白，这与A.oryzae一致。提示这些区别可能与酵母菌和丝状真菌极性生长、菌落形态及分泌功能上的差异有关。
　　 利用生物信息学方法在稻瘟病菌中预测并克隆出一个R-SNARE蛋白的编码基因命名为Mgsec22，Southern杂交结果显示该基因在稻瘟病菌基因组中为单拷贝。酵母突变体功能互补实验证明，尽管MgSEC22蛋白序列与酵母菌Sec22p在进化距离上相距较远，但在功能上具有相似性。进一步通过定向的基因敲除方法对其进行了初步的功能探索。结果显示，稻瘟病菌Mgsec22突变体与野生型相比气生菌丝稀薄，生长速率缓慢，几乎不产生分生孢子，致病力丧失；但该基因突变后对各种细胞壁胁迫因子的耐受性增强：CFW染色观察发现突变体细胞壁结构发生改变，几丁质含量明显提高。已证明活性氧与细胞分化、致病性等密切相关，本文中NBT染色观察到该基因的突变体菌丝中活性氧含量显著降低，进一步Real-time RT-PCR分析表明与活性氧产生相关的两个NADPH氧化酶基因Nox1和Nox2表达水平显著降低。过氧化物酶和漆酶在病原菌致病过程中起到重要作用，分光光度法测定发现突变体过氧化物酶和漆酶的活性均明显减弱。同时用各种染色实验及电镜扫描的方法检测液泡的形态及内吞作用，结果显示：突变体液泡的形态并未发生改变，但内吞作用明显受到影响。

目录

文摘

英文文摘

上篇 文献综述

第一章 SNARE蛋白及膜泡运输

1 SNARE作用的一般模式

2 SNARE蛋白的一般结构特征

3 SNARE复合体作用机制

4 SNARE蛋白的调节因子

参考文献

第二章 SNARE蛋白家族的研究概况

1 哺乳动物中SNARE蛋白的研究进展

2 植物中SNARE蛋白功能研究

3 真菌中的SNARE蛋白

4 稻瘟病菌中SNARE蛋白的研究意义

参考文献

下篇 文献综述

第一章 稻瘟病菌SNARE蛋白家族的生物信息学分析

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

参考文献

第二章 稻瘟病菌Mgsec22的功能研究

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

参考文献

附 录 1

附 录 2

攻读硕士学位期间发表的研究论文

致 谢