沙门氏菌草酰乙酸脱羧酶基因的克隆、表达和产物纯化及其生化特性的鉴定

摘要

为了深入了解沙门氏菌草酰乙酸脱羧酶的生化特性及其功能，来源于沙门氏菌的草酰乙酸脱羧酶复合体基因被克隆，并在大肠杆菌中被诱导表达，诱导剂为异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），浓度分别为0.1 mmol·L-1，0.4 mmol·L-1，0.8 mmol·L-1，表达产物通过SDS-PAGE检测，结果发现，在分子量大小约为65kDa处，均出现了一条额外的蛋白条带。另外，活力测定试验证实在大肠杆菌中表达的沙门氏菌草酰乙酸脱羧酶的粗酶液是有活力的。
　　 采用avidin-Sepharose column亲和层析的方法纯化草酰乙酸脱羧酶，其纯化产物纯度较高，经过SDS-PAGE检测后，呈现三条蛋白谱带，他们分别对应于沙门氏菌草酰乙酸脱羧酶的α，β，γ三个亚基。但纯化产物在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳上呈现两条蛋白带，分别将它们再进行SDS-PAGE电泳检测，发现其中一条蛋白带只含有α亚基，另一条蛋白带则含有上述三种亚基。
　　 纯化后的草酰乙酸脱羧酶最适pH为pH6.0左右；在pH6.0-7.0及碱性条件下较稳定；50℃温浴1h后，其活力几乎完全丧失，说明此草酰乙酸脱羧酶不耐高温；实验还表明，0.5 mmol·L-1草酸和20 mmol·L-1丙酮酸几乎完全抑制该酶的活力，1mmol·L-1 Zn2+几乎完全抑制该酶的活力；10-20 mmol·L-1 NaCl对该酶活力有明显激活作用，但200-500 mmol·L-1NaCl对该酶活力却有明显的抑制作用；以上研究结果为进一步探明细菌中草酰乙酸脱羧酶的生理功能奠定了良好基础。
　　

目录

文摘

英文文摘

缩略词对照表

引言

文献综述

1 草酰乙酸脱羧酶的研究进展

1.1 微生物体内的草酰乙酸脱羧酶的种类

1.2 草酰乙酸脱羧酶的定位和其脱羧机理的研究

1.3 草酰乙酸脱羧酶的解离与组装

2 大肠杆菌作为表达宿主菌的研究进展

3.总结与展望

第一章 沙门氏菌草酰乙酸脱羧酶基因的克隆和其在大肠杆菌中的诱导表达

1.材料与方法

1.1 材料

1.2 培养基

1.3 酶和试剂

1.4 沙门氏菌草酰乙酸脱羧酶基因的克隆

l.5 草酰乙酸脱羧酶在大肠杆菌中的诱导表达

1.6 蛋白质SDS-PAGE分析

1.7 草酰乙酸脱羧酶的活力检测

1.8蛋白质含量的测定

2 结果与分析

2.1 草酰乙酸脱羧酶基因的克隆

2.2 不同诱导剂浓度下的沙门氏菌草酰乙酸脱羧酶在大肠杆菌中表达的SDS-PAGE电泳图

2.3 草酰乙酸脱羧酶粗酶液的活力测定

3.讨论

第二章 沙门氏菌草酰乙酸脱羧酶的纯化及其生化特性的鉴定

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 草酰乙酸脱羧酶在大肠杆菌中的诱导表达和分离纯化

1.3 蛋白质SDS-PAGE分析

1.4 草酰乙酸脱羧酶的活力测定

1.5 纯化后的草酰乙酸脱羧酶非变性PAGE与SDS-PAGE的鉴定

1.6 pH对草酰乙酸脱羧酶活力的影响

1.7 草酰乙酸脱羧酶的热稳定性

1.8 草酰乙酸脱羧酶的pH稳定性

1.9 草酸和丙酮酸对草酰乙酸脱羧酶活力的影响

1.0 Na+离子对草酰乙酸脱羧酶活力的影响

1.11 Zn2+离子对草酰乙酸脱羧酶活力的影响

1.12 蛋白含量的测定

2 结果与分析

2.1 亲和柱层析法分离纯化草酰乙酸脱羧酶

2.2 SDS-PAGE分析酶纯化结果

2.3 非变性及SDS-PAGE对纯化后的草酰乙酸脱羧酶的鉴定

2.4 pH对草酰乙酸脱羧酶的活力的影响

2.5 草酰乙酸脱羧酶的热稳定性

2.6 草酰乙酸脱羧酶的pH稳定性

2.7 草酸和丙酮酸对草酰乙酸脱羧酶活力的影响

2.8 Na+离子对草酰乙酸脱羧酶活力的影响

2.9 Zn2+离子对草酰乙酸脱羧酶的活力的影响

3.讨论

参考文献

全文结论与创新之处

存在问题与展望

致 谢