猪链球菌2型重组亚单位疫苗的研制

摘要

猪链球菌2型（Streptococcus suis serotype2， SS2）是一种人兽共患的传染病病原，不仅可引起猪脑膜炎、关节炎、心内膜炎、败血症、肺炎和突然死亡，还可感染相关人员并致死，在我国和其他养猪业发达的国家已多次流行，对养猪业造成了巨大的经济损失.
　　 猪链球菌2型能产生多种毒力因子，如溶血素、溶菌酶释放蛋白、胞外因子等.溶血素能刺激机体产生免疫保护作用，且各型猪链球菌均能产生生化和免疫特性相似的溶血素。因此，溶血素能对各型链球菌感染产生交叉保护作用.对我国江苏及其周边地区的流行病学调查显示，来自疫区的SS2均为对猪油强毒力的MRP+E F+表现型，由此可见MRP与EF在致病过程中的重要作用，本实验对具有免疫原性的MRP-EF与SLY蛋白进行表达，以期制造出可以对猪链球菌2型进行有效预防的基因工程疫苗.
　　 将已经构建好的重组质粒pET32a-MRP-EF与pET32a-SLY转入大肠杆菌BL21中，优化诱导时间、IPTG浓度、温度等诱导条件大量表达出分子量分别约为74kD和36kD的融合蛋白，并利用亲和层析的方法纯化两种蛋白，两种蛋白免疫转印均可被SS2的抗血清识别，具有免疫原性.
　　 将纯化好的猪链球菌2型MRP-EF与SLY重组蛋白作为抗原包被ELISA板建立检测两种免疫原产生抗体的ELISA方法。试验的最佳反应条件为：抗原包被浓度分别为1.25μg/mL和0.78μg/mL，血清1:200稀释；一抗反应时间为90min，二抗反应时间分别为60min和45min，具有较高的稳定性、特异性和敏感性.
　　 通过基因工程技术分别表达了猪链球菌2型MRP-EF与SLY两种重组蛋白，分别或1∶1混合，与不同佐剂混合乳化，设立免疫剂量梯度，免疫BALB/C小鼠，并以链球菌2型全菌灭活苗作对照，二免后用SS2-1活菌攻击，并采集各组血清，间接ELISA测定效价.结果显示，试验组保护效果优于对照组；MRP-EF+SLY免疫组的保护效果优于其他试验组和对照组，其中25μg蛋白组合免疫的小鼠保护力等同于50μg蛋白组合.试验证实两种蛋白各25μg时为最佳免疫剂量.ISA佐剂效果最佳.
　　 取表达猪链球菌2型MRP-EF与SLY的两种重组菌的表达产物rMRP-EF及rSLY，分别或1:1混合，与ISA206佐剂混合乳化，免疫仔猪，并以猪链球菌2型全菌灭活苗作对照.二免后用SS2-1活菌攻击，并采集rMRP-EF/rSLY组及全菌灭活疫苗组仔猪的血清，间接ELISA测定效价.结果显示，rMRP-EF/rSLY组rMRP-EF与rSLY的抗血清效价分别均为1:12800、1:25600.rMRP/rEF及全菌灭活疫苗免疫仔猪具有较好的保护率，为80％(4/5)及100％(5/5)，而rSLY保护率为60％。

目录

文摘

英文文摘

引言

上篇 文献综述

第一章 猪链球菌2型的研究进展

1 病原学

2 流行病学

3 临床症状

4 对动物与人的致病性

5 致病机理

6 毒力因子

7 检测方法

8 猪链球菌疫苗研究现状

参考文献

下篇 试验研究

第二章 猪链球菌2型MRP-EF与SLY部分片段的原核表达与纯化

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

参考文献

第二章 rSLY与rMRP-EF抗体检测方法的初步建立

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

参考文献

第三章 猪链球菌2型rMRP-EF与rSLY重组亚单位疫苗BALB/C小鼠免疫试验

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

参考文献

第四章 猪链球菌2型重组亚单位疫苗仔猪保护性实验

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

参考文献

全文总结

附录

致谢