番茄离体根双重培养体系建立及其菌根形成信号分子初步鉴定

摘要

丛枝菌根(AM)真菌与80％以上陆生植物形成互惠共生体－丛枝菌根。AM真菌促进宿主植物矿质营养吸收，增强抗逆抗病能力，对维持陆生生态系统及植物多样性有重要作用。二者共生关系的建立，关键受植物分泌的次生代谢物质所影响，从而导致AM真菌的定向生长、分支、附着胞等的形成，利用离体根双重培养体系对试验材料樱桃番茄Micro-Tom野生型和菌根侵染突变体(Myc-)m161根系分泌物进行研究有助于了解AM真菌与植物间相互作用的关键信号物质，具有重要的意义。
　　 因此，本文(1)利用发根农杆菌Agrobacterium rhizogenes诱导樱桃番茄Micro-Tom产生毛状根，并在此基础上成功建立了丛枝菌根（AM）真菌根内球囊霉Glomusintraradices与转移RiT-DNA番茄离体毛状根的双重培养体系。(2)利用高效液相色谱分离并收集樱桃番茄Micro-Tom野生型根系分泌物中与菌根侵染突变体(Myc)m161关键的差异物质，再将其回补到双重培养体系中，观察比较差异物质的加入对AM真菌侵染突变体m161的影响。主要研究结果如下：
　　 1、利用发根农杆菌A4诱导樱桃番茄Micro-Tom长出毛状根，建立毛状根离体培养系统。结果表明：下胚轴共培养法转化效率最高；500mg/L羧苄青霉素的抗生素浓度是除去发根农杆菌A4的最佳条件；毛状根的生长曲线呈“S”型，21d左右生长达到最大量，最大可增加25倍；PCR检测结果证明Ri质粒的T-DNA已成功整合到了樱桃番茄毛状根基因组中。
　　 2、将转移RiT-DNA番茄根与丛枝菌根(AM)真菌根内球囊霉Glomus intraradices建立双重培养体系。结果表明：该真菌侵染14天左右，菌丝开始形成多级分支，17～21天时，一些菌丝顶端膨大，长出新生孢子。接种后3个月时，每皿袍子数量达到600～800个。新形成的孢子无需休眠，可直接侵染番茄离体根。成功的番茄双重培养为番茄菌根生理分子机制的研究提供了理想的实验体系。
　　 3、液体培养法收集樱桃番茄Micro-Tom野生型和菌根侵染突变体(Myc-)m161的根系分泌物，通过高效液相色谱法检测二者根系分泌物中物质含量的差异。结果表明：在某相同条件下，某一相同洗脱时间，WT与m161根系分泌物中物质有明显不同。
　　 4、通过回补实验将收集到的目标物质加入到菌根侵染突变体( Myc-)m161的双重培养体系中，检测该物质在AM真菌侵染宿主时的作用。结果表明：加入目标物质的m161培养体系中，丛枝菌根（AM）真菌根内球囊霉Glomus intraradices的生长状态与阳性对照WT相同，21天时已观察到新生菌丝和新生孢子产生。而阴性对照则在41天时才有少量新生菌丝出现。由此推测，该目标物质有可能是AM真菌与突变体m161共生前期所缺少的关键信号物质。

目录

文摘

英文文摘

缩略语

主要仪器检索表

第一章 文献综述

1 植物丛枝菌根的研究

1.1 丛枝菌根的生物学特征

1.2 菌根共生体形成的信号识别

1.3 双重培养方法对丛枝菌根的研究

2 植物根系分泌物在菌根形成过程中的作用

第二章 樱桃番茄离体根系统的建立

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.2 试验方法

2 结果与分析

2.1 抗生素浓度的确定

2.2 不同诱导方法、不同外植体对侵染率的影响

2.3 毛状根的诱导和筛选

2.4 毛状根生长速率测定

2.5 rolB和rolC基因的PCR分子检测

3 讨论

第三章 丛枝菌根真菌侵染番茄离体毛状根双重培养体系的建立

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.2 试验方法

2 结果与分析

2.1 G.intraradices在M培养基中的生长状况

2.2 G.intraradices对转移RiT-DNA番茄离体根的侵染

3 讨论

第四章 根系分泌物收集和目标活性物质分离

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.2 试验方法

2 结果与分析

2.1 毛状根中活性物质差异

2.2 目标物质制备

3 讨论

第五章 目标物质回补实验

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.2 试验方法

2 结果与分析

2.1 制备物质的质量与浓度

2.2 回补实验中Gi.孢子及菌丝生长情况

2.3 回补实验中Gi.菌丝生长变化

3 讨论

全文结论

参考文献

创新点

附录

攻读学位期间发表和完成的论文目录

致谢