水稻白叶枯病菌Harpin单克隆抗独特型抗体的制备、筛选及其“内影像”特性研究

摘要

位于革兰氏阴性植物病原细菌染色体上的hrp基因簇决定其在非寄主植物上的过敏反应和在寄主植物上的致病性。Hrp基因簇包括编码Ⅲ型泌出通道的基因、调节基因和编码效应蛋白的基因。Harpins是由革兰氏阴性植物病原细菌产生并受hrp基因调节的一类非特异性激发子，具有共同的特征：富含甘氨酸、对热稳定对蛋白酶K敏感。它们通过Ⅲ型泌出通道分泌到细胞膜外并转运到寄主植物的细胞质中，能够在寄主植物上引起致病性，在非寄主植物上引起过敏反应，诱导植物抗病，抗虫，促生长以及提高作物的产量与改善作物品质。HarpinXoo是由水稻白叶枯病菌Xanthomonas oryzaepv.oyzae的hrf1基因编码的蛋白质，大小为139个氨基酸(15.6kDa)，具有与其它harpins类似的生物学活性，但在结构和组成上，它显示一些其它harpins不具有的独特性质，如含有其它harpins不具备的半胱氨酸等。
　　 植物拥有一套天然的免疫系统，使得它们能够抵御外界病原物的侵染。高等植物的HR，快速在病原物侵染点形成坏死斑，死亡细胞可以将侵入寄主体内的病原物限制在侵染点周围，阻止病原物的进一步扩展而实现局部抗病性，是植物针对多种病原物的主动防御，可进一步激活植物抗病防卫信号通路，使植物获得对此后侵入的多种类型病原物的系统抗病性（systemic acquired resistance， SAR）。当harpin被注射到非寄主植物叶片中时，最显著的特征就是引起过敏反应，而harpin的活性位点是如何被植物细胞识别，在什么部位识别，目前还不清楚。在本研究中，我们引入了一种研究植物-病原菌互作的新方法，应用基于Jerne的免疫网络学说制备出的单克隆抗独特型抗体模拟harpin的活性位点，探索harpin在非寄主植物中受体。本论文着重对以下几方面进行了研究。
　　 1 HarpinXoo蛋白的提取与纯化
　　 在本研究中，作者从水稻白叶枯病菌PXO99基因组DNA中扩增出hrf1基因，用NdeⅠ和HindⅢ双酶切，随后插入到到pET30a(+)载体的NdeⅠ和HindⅢ两酶切位点之间，获得了重组质粒pET30a(+)-hrf1，转化宿主菌BL21(DE3)表达融合蛋白。表达菌株E.coli BL21/pET-hrf1在37℃，225rpm经1mM IPTG诱导培养3小时后收集菌体，在100℃沸水中煮10分钟，提取HarpinXoo蛋白，离心分离菌体，蛋白溶解在提取缓冲液中。SDS-PAGE电泳分析表明，获得了大小为16.8kDa蛋白质。注射烟草叶片，引起过敏反应，说明提取到的蛋白为Harpin。用Ni柱对粗蛋白进行纯化，最终获得了单一条带的Harpin蛋白。
　　 2兔源多克隆抗-Harpinxoo抗体(Ab1)的制备与纯化
　　 500μg纯化的HarpinXoo溶解于灭菌的PBS中，与等体积的福氏完全佐剂混合乳化后皮下多点注射与肌肉注射交叉免疫新西兰大白兔，随后的加强免疫用200μg抗原与福氏不完全佐剂混合乳化，每两周免疫一次。六周后，采集兔血清用间接ELISA法测定效价，以免疫前三天采集的阴性血清作对照。ProteinA/G亲合层析柱纯化兔源多克隆抗血清，获得多克隆抗-HarpinXooIgG。HarpinXoo注射烟草引起的过敏反应能被兔源多克隆抗体Ab1抑制，甚至完全阻止，说明Ab1结合harpin的一个或多个活性位点，而这些活性位点可能是非寄主植物中受体的结合位点。
　　 3体外、体内都具有抑制活性的单克隆抗-Harpinxoo抗体的制备
　　 Balb/c小鼠接受四次免疫注射纯化的HarpinXoo后，选取效价最高的一只小鼠做融合，制备杂交瘤细胞。间接ELISA法筛选，有限稀释法亚克隆，两轮筛选后获得6株单克隆抗HarpinXo杂交瘤细胞(2A10、3H12、4B2、4F7、6G4、7F11)。ELISA叠加实验表明，HarpinXoo上的四个表位被6株单克隆细胞株所识别，其中被6G4识别的表位为HarpinXoo引起烟草过敏反应活性位点。体外研究表明，6G4能够与烟草叶片总蛋白竞争性地结合HarpinXoo，最重要的是在体内，6G4能够部分抑制HarpinXoo引起的烟草过敏反应。6G4显然为一个非常合适的免疫原来制备具有Harpinxoo活性位点“内影像”特征的抗独特型抗体。阐明6G4在体外、体内的反应特性将有助于鉴定引起烟草过敏反应的harpin的关键区域。
　　 4具有HarpinXoo“内影像”特征的抗独特型抗体的制备与特性分析
　　 用固定化的胃蛋白酶消解纯的兔源多克隆抗体Ab1获得F(ab＇)2片段，具有抗原结合活性的F(ab＇)2被用作免疫原来制备具有HarpinXoo“内影像”特征的抗独特型抗体。为制备单克隆抗独特型抗体Ab2,F(ab＇)2片段和福氏佐剂乳化后免疫小鼠。随着免疫次数的增加，小鼠血清中抗独特型抗体的浓度也在增加。Ab2能够抑制Ab1与harpin的结合，当抑制率达到50％时，三只小鼠血清的稀释倍数分别为：鼠1(917)＜鼠2(1094)＜鼠3(2540)。因此我们选取竞争抑制效果最好的小鼠3进行细胞融合。
　　 应用间接ELISA法和竞争抑制ELSIA法筛选具有HarpinXoo“内影像”特征的抗独特型抗体。用间接ELISA法初步筛选，获得224株抗Ab1的阳性克隆，进一步用竞争ELSIA法筛选，抑制率达到50％以上的细胞株仅获得23株。经过第一轮筛选，具有全部抗独特型抗体的特征并能稳定分泌抗体的细胞株6B2被筛选出来。竞争ELISA结果表明，6B2与Ab1的结合受harpin抑制，但不受其它无关蛋白如：BSA抑制，这进一步可以说明6B2与Ab1的结合位点可能为独特型结合位点。6B2与HarpinXoo竞争性地结合非寄主植物中推定的harpin受体，这是本研究的关键所在。6B2与受体的结合位点和harpin与受体的结合位点可能为同一个活性位点或非常相近的活性位点。6B2与非寄主植物中推定受体的结合可能是交叉反应的结果，或者受体构象发生改变结果，然而，也有可能是两种机制共同作用的结果。6B2免疫新西兰大白兔进一步诱导出与兔源多克隆抗体Ab1相同或相似活性的Ab3，这就佐证了我们制备的抗独特型抗体6B2确实具有HarpinXoo的“内影像”特征。这些结果表明，6B2具有抗原相似性，即，抗独特型抗体6B2可以充当HarpinXoo抗原的“内影像”，因此，根据Jeme的系统命名法，6B2可以归类为Ab2β。
　　 总之，应用抗独特型抗体进行抗原模拟是探索生物体内含量非常低的受体的一种可行方法。这种方法涉及到多种学科，如：蛋白质化学、酶学、免疫学以及蛋白质-蛋白质互作，其应用也是非常广泛的，如：功能模拟，用作探针鉴定受体和免疫组织化学定位。

目录

文摘

英文文摘

英文缩略词表

前言

上篇 文献综述

第一章 植物病原细菌的Harpins及在植物上的作用

1 植物病原细菌的致病岛和hrp基因簇

2 Harpins在植物上的效应及作用机理

3 HarpinXoo的特性及在植物上的作用

第二章 抗独特型抗体的理论与应用

1 独特型与抗独特型抗体的基础理论

2 抗独特型抗体

3 抗抗-Ⅰd的应用

4 小结

第三章 抗独特型抗体的分子模拟机制及其应用研究进展

1 抗独特型抗体的分子模拟机制

2 “内影像”抗独特型抗体Ab2β的应用研究进展

下篇 研究内容

第一章 水稻白叶枯病菌hrf1基因编码的

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

EXPRESSION IN VITRO OF RECOMBINANT HARPINxooENCODED BY HRF1GENE FROM XANTHOMONAS ORYZAE PV.ORYZAE ABSTRACTER

第二章 HarpinXoo抗体制备及免疫学分析

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

PRODUCTION OF RABBIT ANTI-SERA AND MONOCLONAL ANTIBODY AGAINST HARPINxooAND IMMUNOLOGICAL ANALYSIS ABSTRACTER

第三章 Harpinxoo抗独特型抗体制备及特性分析

1 材料与方法

2 结果与分析

PRODUCTION AND CHARACTERIZATION OF MONOCLONAL AXTI-IDIOTYPIC ANTIBODY IIAVING THE PROPERTY OF MIMICY OF IIARPINxoo ABSTRACTER

参考文献

总结、创新点及展望

攻读博士学位期间发表论文

致谢