表达绿色荧光蛋白重组狂犬病病毒Flury-LEP的构建及其用于中和抗体检测的研究

摘要

狂犬病街毒是一种嗜神经性，能引起几乎所有哺乳动物发生脑神经炎和100％致死性的病毒。其属于弹状病毒科，狂犬病病毒属，基因组为单股负链RNA病毒。基因组长约12kb，负责编码5种结构蛋白：核蛋白，磷蛋白、基质蛋白、糖蛋白和大转录蛋白。核蛋白、磷蛋白、大转录蛋白和病毒的基因组构成核蛋白体复合物（RNP），仅有它才能启动病毒复制和蛋白表达。
　　 我国是狂犬病发病最为严重的地区之一，近些年发病人数逐年增加，每年的发病人数都在3000～4000之间。数据显示，人狂犬病例中93％都是由犬咬伤发病的，因此，犬的免疫预防成为对于预防人的狂犬病是非常重要的。
　　 为获得活的病毒载体疫苗和便利的病毒检测方法。选用了有很好免疫原性，在我国广泛用于制备人狂犬病灭火苗、制备动物弱毒苗和灭活苗的Flury-LEP疫苗株，用于建立反向遗传学系统。在此基础上，表达绿色荧光蛋白的重组LEP-EGFP病毒被拯救，并进行了分析。本研究为研制以Flury-LEP株病毒活载体多价疫苗、高效安全的基因修饰疫苗奠定了基础，同时为检测病毒中和抗体提供了更为方便和经济新方法。
　　 1.为获得狂犬病病毒载体，在建立Flury-LEP疫苗株反向遗传学基础之上，通过已知序列设计引物，经SOE-PCR在Flury-LEP cDNA4096nt处突变出PmeⅠ酶切位点。选用EGFP为报告基因，利用PCR引物设计技术在此ORF两端引入本疫苗株L蛋白转录开始和终止序列，以及PmeⅠ位点，将此报告基因克隆入病毒cDNA PmeⅠ位点处构建了表达绿色荧光蛋白（GFP）的重组LEP基因组cDNA克隆pCI-LEP-EGFP。将PCI-LEP-EGFP和辅助质粒PCAGG-N、PCAGG-P、PCAGG-L共转染293T细胞，荧光显示成功拯救重组病毒LEP-EGFP。
　　 2.为获得狂犬病病毒LEP-EGFP作为载体的生物学特性。LEP-EGFP和野生型LEP（wtLEP）以M.0.I.为0.01分别感染NA细胞和BHK-21细胞，在24h、72h和120h取样滴定，生长动力学特性与亲本株无明显差异。wtLEP和LEP-EGFP分别颅内接种Balb/c雌性小鼠，Reed-Muench法计算LD50分别为6.3个FFU和8.8个FFU，两毒株小鼠的致病性没有显着差异。LEP-EGFP在BHK-21细胞中连续传代9次，各代保持EGFP的稳定表达及生物学特性不变。
　　 3.为鉴定EGFP表达是否影响Flury-LEP活疫苗载体免疫原性，和开发更为方便、快捷中和抗体检测方法。wtLEP和LEP-EGFP分别以股内侧免疫7周龄Balb/c，三周后采血，所获得的抗体滴度显示了很好的一致性（P>0.05）。比格犬免疫Flury-LEP弱毒苗或灭活苗三周后获得血清，经IFAT（Indirect fluorescent antibody test）和LEP-EGFP直接荧光下检测中和50％攻击毒株抗体滴度，两种方法检测的中和抗体滴度显示很好的相似性（P>0.05）。
　　 本研究获得了重组LEP-EGFP疫苗载体，其在致病性、免疫原性和生长动力学与其母本相似。其用于中和抗体检测，结果与IFAT方法有很好的相似性。本研究将为狂犬病病毒载体活疫苗和中和抗体检测发挥重要作用。

目录

文摘

英文文摘

第一篇 文献综述

第一章 狂犬病病毒分子生物学

1 狂犬病病毒的形态特征与分子结构

2 狂犬病病毒的基因组结构

3 狂犬病病毒结构蛋白和基因组非编码区研究

4 参考文献

第二章 动物负链RNA病毒反向遗传系统建立

1 反向遗传简介

2 反向遗传学研究系统建立的基础

3 反向遗传学系统构建策略

4 反向遗传在RV中的应用

5 参考文献

第二篇 试验研究

第一章 表达增强型绿色荧光蛋白重组狂犬病病毒Flury-LEP株感染性克隆的构建和重组病毒拯救

摘要

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

4 参考文献

5 英文摘要

第二章 表达增强型绿色荧光蛋白重组狂犬病病毒Flury-LEP株生物学特性分析

摘要

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

4 参考文献

5 英文摘要

第三章 LEP-EGFP用于中和抗体检测的研究和LEP-EGFP与wtLEP免疫原性比较

摘要

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

4 参考文献

5 英文摘要

全文结论

附录

致谢

课题资助

攻读硕士期间发表的论文