小麦根尖细胞中一种响应盐胁迫与细胞死亡相关的内肽酶及其生化特性研究

摘要

盐分是影响植物生长和产量的一个重要环境因子，盐胁迫会降低水势并导致细胞内离子失衡，产生毒害，从而导致植物生长量降低甚至死亡。而小麦根尖是植物最先感应盐胁迫的部位，它能够使植株对此做出一系列的适应性反应。因此探索盐胁迫下的小麦根尖细胞的生理生化性质，尤其在蛋白质水平的变化具有重要意义。
　　 内肽酶（endopeptidase，简称EP，也称蛋白酶）参与了调节植物衰老过程中蛋白质的降解，而其活力在衰老期间显著上升。本文以小麦（3E-158）为材料，初步探讨了在一定浓度的盐胁迫下和不同浓度的Hemin（外源CO供体）缓解盐胁迫下小麦根尖细胞的氧化损伤和蛋白降解情况，并深入研究了与盐胁迫相关的内肽酶同工酶的活性变化及其生化特性，主要研究结果简述如下：
　　 我们采用200 mmol·L-1的NaCl对根长长至6～8cm的小麦开始进行盐胁迫处理，结果发现，小麦根长随着盐胁迫时间的延长明显逐渐受到抑制，胁迫第4天根长仅为对照的68.9％；小麦根尖细胞中TBARS含量在胁迫第一天达到了相应对照（C）的2倍，此后随着盐胁迫时间的延长仍然维持在一个相对比较高的水平上；O2产生速率随着处理时间的延长也呈现不断的增高趋势。采用相应处理的小麦根尖进行全基因组DNA电泳检测分析，发现在盐胁迫第2天，细胞内出现明显DNA Ladder，到第4天仍然发现有较模糊的Ladder现象。以上结果表明，200 mmol·L-1的NaCl胁迫使小麦根生长受到抑制，对其生理生化活动也已造成一定程度的伤害。
　　 为研究盐胁迫下小麦根尖细胞内肽酶同工酶的变化情况，我们采用以明胶为底物的梯度凝胶电泳活性染色方法。结果发现，在200 mmol·L-1的NaCl胁迫第三天开始，有一种内肽酶同工酶活性显著增强，且随着盐胁迫时间的延长该酶活性继续增强。对该酶进行生化特性研究分析，发现该酶在pH3.0-10.0的较宽pH范围内和20℃-80℃较宽的温度范围内均表现有活性，说明该酶生化性质比较特殊，不仅能耐一定的酸碱，而且能耐一定的高温。该酶最适pH为pH6.0，最适温度为40℃。继续在pH6.0和40℃的反应条件下对该粗酶液进行热稳定性分析，发现在4℃-50℃保温一小时后该酶活性维持不变。用内肽酶抑制剂分析，显示该酶活性明显被丝氨酸型内肽酶抑制剂PMSF，金属离子型内肽酶抑制剂EDTA和EGTA所抑制，其中PMSF抑制作用最强。
　　 我们采用不同浓度的外源CO供体（Hemin）与200 mmol·L-1 NaCl共处理4 d后发现，在1μmol·L-1和5μmol·L-1 Hemin影响下，与无Hemin处理的盐胁迫组相比，小麦根长相对增长了5.3％和1.3％，小麦根尖细胞内TBARS含量分别降低了10.7％和13.6％，超氧根阴离子产生速率也分别下降了17.1％和28.2％，细胞内可溶性蛋白质含量则增加了41.3％和22.5％。而以上指标在0.1μmol·L-1的Hemin影响下差异不显著。当我们采用10μmol·L-1和20μmol·L-1的较高浓度Hemin处理盐胁迫下的小麦，以上指标非但未呈现出缓解现象，反而有加剧损伤的趋势。因此我们推断，1μmol·L-1和5μmol·L-1 Hemin应该是缓解盐胁迫下小麦根尖细胞死亡的合适浓度，而其中尤以5μmol·L-1最为显著。采用以明胶为底物的梯度凝胶电泳活性染色方法研究Hemin对盐胁迫下小麦根尖细胞内肽酶EP活性的影响。结果发现在0.1μmol·L-1、1μmol·L-1和5μmol·L-1 Hemin处理下，内肽酶EP活性均有降低，其中更以0.1μmol·L-1和5μmol·L-1的Hemin处理的下降最大。

目录

文摘

英文文摘

缩略词对照表

文献综述

1 植物盐胁迫研究进展

1.1 盐胁迫下的植物生理

1.2 盐胁迫对细胞膜的影响

1.3 盐胁迫诱导下的植物细胞程序性死亡

2 CO与植物非生物胁迫研究进展

3 植物体内蛋白水解酶研究进展

3.1 蛋白水解酶的定位

3.2 蛋白水解酶的降解机理

3.3 蛋白水解酶与植物衰老的关系

引言

第一章 盐胁迫对小麦根长及根尖细胞生理生化特征的影响

1．材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

2．结果与分析

2.1 盐胁迫下对小麦根长的影响

2.2 根尖细胞DNA电泳检测结果

2.3 盐胁迫下根尖超氧根阴离子（O2-）产生速率的变化

2.4 盐胁迫下小麦根尖膜脂过氧化程度的变化

3．讨 论

第二章 盐胁迫下小麦根尖细胞内一种内肽酶的变化和生化特性研究

1．材料

1.1 小麦根尖（同第一章）

1.2 叶片

2．方法：

2.1 根尖粗酶液的提取

2.2 根尖可溶性蛋白质含量测定

2.3 内肽酶同工酶活性梯度凝胶电泳

2.4 内肽酶生化特性分析

2.5 小麦叶片粗酶液的提取

3．结果与分析

3.1 盐胁迫下小麦根尖细胞可溶性蛋白含量变化

3.2200 mmol·L-1盐胁迫对小麦根尖内肽酶活性的影响

3.3 pH对根尖内肽酶同工酶活性的影响

3.4 温度对根尖内肽酶同工酶活性影响

3.5 小麦根尖内肽酶的热稳定性研究

3.6 蛋白酶抑制剂对内肽酶活性的影响

3.7 盐胁迫下小麦根尖和衰老叶片内肽酶同工酶的比较

4．讨论

第三章 不同浓度的HEMIN处理对盐胁迫下小麦根尖细胞的生理特征变化及内肽酶EP活性的影响

1．材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

2．结果与分析

2.1 Hemin对盐胁迫下小麦根长的影响

2.2 Hemin对盐胁迫下小麦根尖细胞内TBARS含量的影响

2.3 Hemin对盐胁迫下小麦根尖细胞超氧根阴离子产生速率的影响

2.4 Hemin对盐胁迫下小麦根尖细胞可溶性蛋白含量的影响

2.5 Hemin对盐胁迫下小麦根尖细胞内肽酶活性的影响

3．讨论

参考文献

全文结论

创新之处

存在问题与展望

致 谢