脱氧雪腐镰刀菌烯醇诱导仓鼠肾细胞凋亡信号转导机制的研究

摘要

目的：脱氧雪腐镰刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON），又名呕吐毒素（vomitoxin），是由镰刀菌属病原真菌产生的真菌毒素之一。DON广泛污染谷类及其制品，严重威胁人和动物的健康。研究报道DON具有很强的细胞毒性，对于原核细胞、真核细胞等均具有明显的毒性作用，DON可抑制DNA、RNA和蛋白质的合成，抑制线粒体功能并诱导细胞凋亡。其中诱导细胞凋亡是DON发挥致病作用，产生免疫毒性的重要途径之一，也是近年来霉菌毒素研究领域中的热点问题。目前关于DON对细胞毒性研究的报道较多，但关于DON诱导细胞凋亡具体的信号转导机制还很少有报道。鉴于上述情况，本实验选用DON敏感细胞株仓鼠肾细胞BHK-21为研究对象，经DON处理后，观察其对BHK-21细胞的形态学、线粒体膜电位及凋亡通路相关蛋白表达变化的影响，以其探讨DON诱导细胞凋亡的作用机制，为深入研究DON的毒性机理、全面了解DON的生物学作用奠定基础。
　　 试验一：
　　 本试验将处于对数生长期的BHK-21细胞以不同浓度的DON（DON终浓度分别为125、250、500、1000、2000ngmL-1）进行处理，另设空白培养基对照组。24h后，倒置显微镜观察细胞的形态学改变，琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性。结果显示：不同浓度的DON对BHK-21均有诱导凋亡的作用，各浓度组的凋亡率都显著高于对照组（P<0.05）；细胞DNA发生断裂，形成DNAladder。
　　 试验二：
　　 本试验将处于对数生长期的BHK-21细胞以不同浓度的DON（DON终浓度分别为125、250、500、1000、2000ngmL-1）进行处理不同时间（6h、12h、24h）后，JC-1染色，流式细胞仪检测线粒体膜电位的变化情况。结果显示：在DON作用时间（24h）相同的情况下，除125 ng mL-1外，其他各浓度组与对照组相比均差异显著（P<0.05），随着DON浓度的增大，线粒体膜电位下降的程度越明显；在DON浓度（2000 ngmL-1）相同的情况下，各试验组与对照组相比均差异显著（P<0.05），随着DON作用时间的延长，细胞线粒体膜电位呈逐渐下降的趋势。采用细胞免疫化学染色检测不同浓度的DON处理对BHK-21细胞中Bax、Bcl-2、p53表达的变化，结果显示，DON处理细胞24 h，Bax，p53蛋白表达显著高于对照组，Bcl-2蛋白表达均低于对照组。
　　 试验三：
　　 采用蛋白免疫印迹（Western Blotting）检测不同浓度的DON处理对BHK-21细胞中caspase-3、caspase-9、AIF、caspase-12蛋白表达的变化。蛋白免疫印迹结果显示：caspase-3、caspase-9，AIF、caspase-12蛋白分子量分别为35 KD、47 KD、57 KD、55 KD经SDS-PAGE电泳、转膜后，细胞对照组、DON处理组均在相应位置出现了棕色的阳性条带，且随DON浓度的增加阳性条带颜色逐渐加深，宽度逐渐增加。以actin（42KD）作为内参照，采用图像分析系统对杂交条带进行定量分析，进一步证实给予DON处理可以促进BHK-21细胞中caspase-3、caspase-9、AIF、easpase-12蛋白的表达。

目录

文摘

英文文摘

基金项目

符号及缩略语

第一篇 文献综述

第一章 脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）毒性研究进展

1 DON的产生及理化特性

2 DON的污染情况

3 DON的毒性作用

参考文献

第二章 细胞凋亡的研究进展

1 细胞凋亡的概念

2 细胞凋亡的生物学特性

3 CASPASE与细胞凋亡

4 细胞凋亡的主要调控基因

5 细胞凋亡途径与信号转导

6 细胞凋亡的检测

7 DON与细胞凋亡

参考文献

第二篇 试验研究

第三章 DON诱导BHK-21细胞凋亡的形态学变化和DNA损伤的研究

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

参考文献

第四章 DON诱导BHK-21细胞凋亡的线粒体膜电位及凋亡调控基因的表达

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

参考文献

第五章 脱氧雪腐镰刀菌烯醇诱导BHK-21细胞凋亡途径的研究

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

参考文献

全文总结

附 录

致 谢

攻读硕士学位期间发表的论文