脱氧雪腐镰刀菌烯醇诱导人结肠癌细胞凋亡线粒体信号转导机制的研究

摘要

脱氧雪腐镰刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON），又名呕吐毒素（vomitoxin），是由镰刀菌属病原真菌产生的真菌毒素之一.研究报道DON具有很强的细胞毒性，对于原核细胞、真核细胞等均具有明显的毒性作用，DON可抑制DNA、RNA和蛋白质的合成，抑制线粒体功能并诱导细胞凋亡.目前关于DON诱导的细胞凋亡多集中于对其免疫机制的研究，而关于线粒体途径的分子机制报道很少。本试验选用对DON敏感细胞HT-29为研究对象，研究在DON不同浓度梯度作用下，观察体外培养的HT-29细胞的形态学变化；在DON不同浓度梯度作用和时间梯度作用下，诱导HT-29细胞凋亡的线粒体途径中关键凋亡蛋白细胞色素C（CytC）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9（Caspase-9）和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）的表达情况；以及在DON不同浓度梯度作用下，重要的调节肿瘤凋亡基因Bc1-2家族中，关键调节因子Bc1-2、Bax和Bid的表达情况。旨在探讨DON诱导体外培养细胞的细胞凋亡下，对线粒体途径中关键调节蛋白及因子的影响，为深入研究DON的细胞毒性研究分子机制提供依据。
　　 试验一：
　　 本试验将处于对数生长期的HT-29细胞以不同浓度的DON（DON终浓度分别为125、250、500、1000、2000 ng·mL-1）进行处理，另设空白培养基对照组。24 h后，倒置显微镜和透射电子显微镜下观察细胞的形态学变化。结果显示：不同浓度的DON对HT-29细胞均有诱导凋亡的作用。光学显微镜下，随着DON浓度的增加，HT-29细胞数量明显减少，提示DON能够抑制HT-29细胞的生长。透射电镜下，对照组细胞可见清晰的细胞核和细胞器，周生微绒毛，染色质聚集，线粒体可见细丝状的嵴。而5个试验组细胞均可见典型的凋亡形态学变化，主要表现为细胞核皱缩、碎裂，染色质聚集并靠近核膜，周生微绒毛变少甚至消失，有的出现凋亡小体，细胞器线粒体肿胀、空泡化.
　　 试验二：
　　 本试验将处于对数生长期的HT-29细胞以不同浓度的DON（DON终浓度分别为125、250、500、1000、2000 ng·mL-1），另设空白培养基对照组，进行处理24 h后，采用SDS-PAGE凝胶分离蛋白，Western blotting分析CytC、Caspase-9、Caspase-3和内参蛋白β-actin的表达。结果显示：不同浓度DON作用HT-29细胞24h之后，DON浓度分别为1000、500、1000 ng·mL-1时，达到诱导激活凋亡蛋白Cyt C、Caspase-9和Caspase-3相对表达量的峰值，与对照组差异均极显著（P<0.01）。HT-29细胞Caspase-9蛋白的相对表达量在DON浓度为125.500 ng mL-1范围时，随DON浓度增高而增多。Caspase-3蛋白的表达量在500-1000 ng mL-1范围时，随DON浓度增高而升高，在2000 ng mL-1时，相对表达量有所下降；Cyt C的表达量在125-1000 ng mL-1范围时，随DON浓度升高也逐渐升高，在2000 ng mL-1时表达略微下降。
　　 同时，将处于对数生长期的HT-29细胞，以DON500ng·mL-1处理HT-29细胞，作用细胞0，3、6、12、24、48h后，同样采用SDS-PAGE凝胶分离蛋白，Western blotting分析Cyt C、Caspase-9、Caspase-3和内参蛋白β-actin的表达情况。结果显示：凋亡蛋白Caspase-9和Caspase-3均在DON作用HT-29细胞12h后，其相对表达量达到峰值，与对照组差异极显著（P<0.01）；随着DON作用时间的延长，24、48 h后，两者蛋白的相对表达量逐渐下降，但Caspase-9表达量略低于对照组，Caspase-3反高于对照组。凋亡蛋白Cyt C于DON作用6 h后，其表达量达到峰值，与对照组相比差异极显著（P<0.01）。随作用时间的延长，其表达量呈下降趋势，并且在作用24、48 h后，表达量明显低于对照组。
　　 试验三：
　　 本试验将处于对数生长期的HT-29细胞以不同浓度的DON（DON终浓度分别为125、250、500、1000、2000 ng·mL-1）进行处理，另设空白培养基对照组。24 h后，用荧光定量PCR方法检测Bc1-2、Bax、Bid基因和内参基因GAPDH的变化。结果显示：目的基因Bc1-2、Bax、Bid随DON浓度的增加，Bc1-2和Bax其相对表达量分别在500、1000 ng.mL-1作用时达到相对表达量的峰值.与对照组相比，Bc1-2随DON浓度的增加呈现上升趋势，在达到峰值后表达下降。Bax随DON浓度增加（125、250、500 ng·mL-1），其表达略降，在1000、2000 ng·mL-1时表达增加，并在1000 ng·mL-1时达到峰值，变化情况与Bcl-2相反。Bid随DON浓度的升高，其表达呈下降趋势，在2000 ng·mL-1时达到最低表达量。而Bc1-2与Bax表达量的比值显示，在500 ng·mL-1时其比值最大，随后随DON浓度增加，高剂量反而低于低剂量比值。

目录

文摘

英文文摘

基金项目

符号及缩略语

第一篇 文献综述

第一章 脱氧雪腐镰刀菌烯醇毒理学研究进展

1 DON的理化特性

2 DON的污染情况

3 DON的毒性作用

参考文献

第二章 脱氧雪腐镰刀菌烯醇与细胞凋亡研究进展

1 细胞凋亡

2 细胞凋亡的线粒体信号转导路径

3 线粒体凋亡的主要调控基因

4 DON与细胞凋亡

参考文献

第二篇 试验研究

第三章 DON诱导HT-29细胞凋亡的形态学变化

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

参考文献

第四章 DON诱导HT-29细胞凋亡的线粒体途径相关蛋白的表达

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

参考文献

第五章 DON诱导HT-29细胞凋亡对凋亡调控基因Bcl-2家族的影响

1 材料和方法

2 目的基因引物设计

3 实时荧光定量PCR

4 统计学处理

5 结果

6 讨论

参考文献

全文总结

附 录

致 谢