产酶溶杆菌生防相关基因的克隆、功能分析及工程菌构建

摘要

产酶溶杆菌（Lysobacter enzymogenes）OH11是本实验室从辣椒根际土壤中分离得到的一种新型生防菌，属溶杆菌属（Lysobacter）、黄单胞科(Xanthomonadaceae)。该菌GC含量较高，有滑行现象，能产生多种胞外酶，包括几丁质酶、蛋白酶、纤维素酶、β-1,3-葡聚糖酶，对许多植物病原真菌、卵菌具有很好的拮抗活性。本研究旨在建立产酶溶杆菌OH11的遗传操作系统，构建转座子随机插入文库，并以此为基础，克隆色素和胞外多糖合成相关基因，并对克隆基因进行功能分析，以明确色素和胞外多糖在该菌定殖、拮抗和生防中的功能。同时，构建具有降解酰基高丝氨酸内酯类信号分子（AHL）能力的产酶溶杆菌工程菌株，用于防治植物细菌病害，拓宽其生防范围。
　　 首次利用mariner转座子对产酶溶杆菌OH11进行了转座诱变，成功构建产酶溶杆菌OH11的转座子随机插入文库。在几丁质选择性培养基上，根据菌落周围是否产生水解圈，成功从OH11突变株文库中筛选出4个几丁质酶缺失突变株。利用建立的任意PCR（abritrary PCR）技术，快速鉴定了mariner转座子在4个几丁质酶缺失突变株中的插入位点。序列分析表明插入位点涉及调控基因clp，几丁质酶编码基因chiA，羧基末端蛋白酶（carboxyl-terminal protease）编码基因cptA和未知蛋白(hypertheticalprotein)编码基因。随后，以chiA为报道基因，分析了3种不同类型的自杀质粒(pMW91CM， pjQ200SK, pEX18GM)在OH11中用于完成基因定向敲除的可行性，确定了自杀质粒pEX18GM可以有效地在OH11中完成基因的定向插入失活和缺失敲除，并构建了chiA的缺失突变株。有趣的是，chiA缺失突变株不改变对水稻纹枯病菌（Rhizoctonia solani，）、油菜菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum）、小麦赤霉病菌（Fusarium graminearum）和辣椒疫霉（Phytophthora capsici）的拮抗活性，揭示在防治这四种病原真菌或卵菌时，几丁质酶并不是主要的胞外酶。利用来自于大肠杆菌的组成型强启动子Plpp，实现了chiA基因的互补及外源基因gfp的表达，成功构建了基于质粒的功能基因互补系统和外源基因表达系统。本部分建立的产酶溶杆菌OH11的遗作操作系统，为后续研究OH11的生防分子机理及工程菌的构建奠定了基础。
　　 结合表型筛选和验证，从OH11的突变株文库中筛选到2株色素突变株，分别命名为OH11H和OH11B。在LA平板上，野生型OH11产生黄色素，菌落为黄色。色素突变株OH11H可以产生可溶性的黑色素，但其菌落仍为黄色；OH11B菌落形态为白色，缺失了黄色素的合成。通过任意PCR和亚克隆技术，鉴定了转座子在OH11H和OH11B中的插入位点分别为hmgA基因和acp基因。hmgA基因编码尿黑酸1.2-加氧化酶，参与酪氨酸的代谢。而acp基因编码3-羰基（酰基载体蛋白）合成酶Ⅰ，与脂肪酸生物合成(FAS)相关。在前期以chiA基因作为报告基因筛选自杀载体的基础上，本研究再次以hmgA为报告基因，验证不同类型的自身载体在OH11中完成基因定向敲除的可行性，并再次确认在参试的自杀载体中，只有pEX18GM才能完成靶标基因的定向缺失敲除，与前期筛选结果一致。通过同源重组技术，分别构建了hmgA和acp的定向敲除突变株，并明确hmgA的突变改变了OH11的细胞形态，使细胞从棍棒状变为椭圆状，但不改变菌落形态；提高了OH11生物膜形成能力、在水稻叶片上的定殖能力及对水稻纹枯病的防效，但不改变OH11胞外多糖形成能力、4种胞外酶的产生能力和平板拮抗活性。明确了acp的突变不改变OH11的细胞形状，但使细胞周围“多糖”类物质增加，降低了OH11生物膜形成能力，在水稻叶片上的定殖能力及对水稻纹枯病的防效，同样不改变OH11胞外多糖形成能力、4种胞外酶的产生能力和平板拮抗活性。此外，还初步明确了可溶性黑色素和菌体自身的黄色素可能与细菌抵御紫外光损伤无关。
　　 结合表型筛选和验证，从OH11的突变株文库中筛选到5株胞外多糖（exopolysacchide， EPS）缺失突变株，分别命名为MEPS1-MEPS5。在LAS培养基上，野生型OH11菌落黄色、饱满、光滑，而EPS缺失突变株菌落干燥、皱缩，但菌落仍为黄色。通过任意PCR技术（arbitrary PCR），快速鉴定了转座子在MES1-MES5中的插入位点分别为别是tonB基因、透性酶(permease)编码基因、Ⅳ分泌系统中Pilin蛋白编码基因，以及未知蛋白编码基因，表明众多基因参与了EPS的合成。在任意PCR的基础上，进一步通过亚克隆技术(sub-cloning)，克隆了tonB的完整基因。通过同源重组技术，构建了tonB定向缺失突变株，并明确tonB的突变降低了OH11的滑行能力，改变了OH11的菌落形态，但不改变菌体细胞形态；降低了OH11生物膜形成能力、在水稻叶片上的定殖能力及对水稻纹枯病的防效。初步明确了EPS可能与产酶溶杆菌抵御紫外光损伤相关。
　　 利用大肠杆菌中的组成型强启动子Plpp实现了外源基因即AHL类信号分子降解基因aiiA在产酶溶杆菌OH11中的重组表达，构建了抗生素标记的工程菌株OH11A。菌株OH11A能显著降解不同植物病原细菌产生的AHL类信号分子。在离体生防试验中，OH11A能大幅度降低软腐病菌对大白菜的致病性，但不抑制软腐病菌在寄主组织中的生长。在活体生防试验中，OH11A能分别显著降低软腐病菌和西瓜果斑病菌对仙人掌和甜瓜苗的毒性。在后续工作中，我们以lacZ为报告基因，构建了基于广宿主载体pBBR1-CMS5的新型启动子探针pBBRLACZR。利用该探针，从产酶溶杆菌OH11的启动子文库中筛选到一个具有启动子功能的DNA片段，通过启动子亚克隆并结合反复的筛选验证，最终从OH11中克隆了一个组成型强表达的启动子PB500。以前期工作中克隆的hmgA为同源重组靶标基因，以SacB为反向筛选标记，将外源融合基因PB500-aiiA定向整合到hmgA中，构建了无标记、稳定遗传并能显著降解信号分子AHLA的工程菌株OH11PA。工程菌株OH11PA能显著降低软腐病菌在大白菜上的毒性。

目录

文摘

英文文摘

上篇 文献综述

第一章 溶杆菌防治植物病害的研究进展

1 分类和鉴定

2 生境及生态学

3 溶杆菌的拮抗及生防机理

4 生物防治系统

5 菌剂创制

6 前景展望

参考文献

第二章 细菌群体感应与群体淬灭

1 细菌群体感应

2 细菌群体淬灭

参考文献

下篇 研究内容

第一章 产酶溶杆菌OH11新型遗传操作系统的建立及应用

1 材料与方法

2．结果分析

3 讨论

参考文献：

第二章 产酶溶杆菌色素合成相关基因hmgA和acp的克隆与功能分析

1 材料与方法

2 结果分析

3 讨论

本章小结

参考文献：

第三章 产酶溶杆菌胞外多糖合成相关基因tonB的克隆与功能分析

1 材料与方法

2 结果分析

3 讨论

本章小结

参考文献

第四章 具有降解AHL类信号分子能力的产酶溶杆菌工程菌株的构建与初步应用

第一节 利用lpp启动子实现aiiA基因在产酶溶杆菌中重组表达

第二节 以lacZ为报告基因的启动子探针载体的构建及应用

第三节 具有降解AHL类信号分子能力的产酶溶杆菌无标记工程

本章小结

参考文献

全文总结

本论文创新点

攻读博士学位期间上传GENBANK的基因序列

发表的论文

致谢