华东地区鸭源禽致病性大肠杆菌系统进化群及毒力相关基因特性分析

摘要

禽致病性大肠杆菌（avian pathogenic Escherichia coli, APEC）能引起禽类的心包炎、肝周炎、腹膜炎、败血症等，近年来，脑膜炎型日益增多。APEC血清型多样，有O血清型176种，K型103种，H型83种，且耐药性严重，存在地区及品种差异，难以根除，给畜牧业带来严重危害，同时也是一种人畜共患病病原体,目前APEC的致病机理尚未完全弄清楚。本试验采用PCR、多重PCR及dot blot等方法对华东地区APEC鸭源株的系统进化群及所携带的毒力相关基因进行了调查，并对分离株DE205B侵袭相关基因ibeA进行序列分析、缺失等。
　　 2005-2007年间，从江苏、安徽、山东等华东地区送检的临床疑似大肠杆菌感染的病死鸭中，采集病料分离获得501株细菌。经糖发酵、尿素酶、IMViC等生化试验以及三糖铁琼脂培养试验，并经显色培养基验证，480株确定为大肠杆菌。表明禽源大肠杆菌病在华东地区鸭群中广泛存在，且鸭源APEC变得日益复杂，常见临床症状有心包炎、肝周炎、腹膜炎、关节炎等，其中有神经症状的分离株占74.17％(356/480)；从分离部位看，脑分离株32.08％(154/480)，心脏分离株23.96％(115/480)，肝脏分离株20.21％(97/480)，脾脏、气囊和肾脏分离株分别为10.83％(52/480),4.79％(23/480)、2.50％(12/480)，其它部位也有分离到，与地区、种类、宿主等亦有很大相关性。为了揭示其遗传起源和分子特性，选用一种简便快速的分子分群方法，即通过扩增chuA和yiaA基因及TspE4.C2DNA片段的三重PCR，对这些分离株进行了系统进化群的分析。在华东地区分离的480株鸭源APEC菌株中，A群占56.25％,B2群占19.17％,D群占16.46％,B1群占8.13％，对研究我国APEC的生态分布和遗传进化具有重要参考价值。
　　 设计并合成16对引物，用PCR及多重PCR方法对鸭源APEC的非侵袭相关的16个毒力基因，包括afa/draB、iha、papC,tsh、mat、chuA、fyuA、irp2、iucD、iutA、iroN、iss、kpsMTII,traT、vat和malX进行检测，分析其在480株鸭源APEC中的分布。结果表明，在鸭源APEC中，除了kpsMTII全部阴性，其它均有不同程度的分布，即iutA85.83％(412/480),mat83.13％(399/480)、iss83.13％(399/480)、iroN64.38％(309/480)、iucD63.96％(307/480)、tsh52.71％(253/480)、traT47.71％(229/480)、irp232.50％(153/480)、fyuA27.92％(134/480)、chuA27.29％(132/480)、iha6.88％(33/480)、vat3.13％(15/480)、papC1.88％(9/480)、malX1.04％(5/480)、afa/draB0.21％(1/480)；通过比较还发现16个毒力相关基因在480株鸭源APEC中共存在89种不同的分布模式，含1到13个基因不等，显示华东地区鸭源APEC分离株的毒力基因分布较为复杂。
　　 根据已发表的大肠杆菌侵袭相关基因序列设计并合成11对引物，用PCR及多重PCR方法检测480株鸭源APEC中11个侵袭相关基因片段的分布，包括fimC、sfa/focCD、cvi/cva、neuC、ompA、cnf1/2、hlyA、gimB、ibeA、yijP和aslA，分析鸭源APEC的侵袭相关基因的分布特征。结果显示，在鸭源APEC中，除hlyA、cnf1/2和sfa/focCD全部阴性，其它均有不同程度的分布，即yijP9438％（453/480）、ompA9125％(438/480)fimC80.00％(384/480)、cvi/cva67.29％(323/480)、aslA41.25％(198/480)、ibeA3.96％(19/480)、gimB和neuC均为1.67％(8/480)；比较还发现其存在30种不同的侵袭相关基因的分布模式，含1到7个基因不等，另有一株分离株不含任何侵袭相关基因。可见APEC侵袭相关基因的分布模式的多样化。
　　 为大批量检测禽源大肠杆菌病毒力基因，建立了斑点杂交法。将PCR扩增的ibeA的342bp的保守片段DNA测序验证后标记成地高辛探针，菌液样品直接在带正电荷的尼龙膜上裂解，杂交后用CSPD化学发光法检测靶基因。特异性试验表明，该探针仅与靶基因核酸反应。敏感性检测表明，膜上的最低检出量为1.0×103个大肠杆菌。PCR检测的480株鸭源APEC的菌液样品中，发现19株为ibeA阳性，用斑点杂交法重复三次检测上述样品，阳性率均为3.96％。证明建立的斑点杂交法具有特异、敏感和可重复的特点，可用于大量临床样品或菌液直接检测的初步筛选，尤其对临床症状不明显的大肠杆菌隐性感染的检出更具优势。
　　 鸭源APEC分离株DE205B在与新生儿脑膜炎大肠杆菌(Newbornmeningitis-causing Ecoli,NMEC)RS218的系统进化群相同和含有的毒力相关基因相似的前提下，对其进行了溶血反应、致病性试验和体外感染猪脐静脉微血管内皮细胞（SUMECs）等相关特性的检测。结果发现，DE205B在绵羊血平板上呈β溶血；致病性试验显示，具有常见的大肠杆菌病症状，对小鼠和鸭的LD50分别为3.97×106和1.05×107CFU/ml。且DE205B能够在SUMECs上进行生产性复制：琼脂糖凝胶电泳显示感染细胞的DNA呈“梯样”图谱；光镜下，可见感染细胞的形态发生特征性改变，细胞皱缩，表面微绒毛消失，胞浆内大量空泡出现，细胞核染色体发生浓缩;流式细胞仪检测出细胞在感染后出现凋亡；侵袭率为3.36％.
　　 克隆并分析APEC侵袭相关基因ibeA，探寻其变异与进化发生关系.根据已发表的NMEC株RS218的ibeA的核苷酸序列，设计合成一对引物，以鸭源APEC神经症状脑分离株DE205B基因组DNA为模板，通过PCR技术扩增到ibeA的全基因序列，将检测正确的基因进行测序。结果显示DE205B的ibeA序列编码区为1371bp，编码456个氨基酸，分子量为49544.33dal。核苷酸序列比较表明，与已发表的ibeA基因核苷酸具有较高的同源性（98.9％以上），遗传进化分析显示与NMEC亲缘关系很近。
　　 将pKD46质粒电击转化APEC株DE205B,PCR扩增两翼与目的基因ibeA同源的卡那霉素抗性基因片段，电击转化DE205B/pKD46菌株，借助Red系统的重组功能，置换DE205B基因组中的ibeA基因，并通过导入编码FLP位点特异性重组酶的质粒pCP20，去除抗性基因标志。对重组菌主要生物学特性的研究表明，ibeA基因缺失株生长能力稍慢于野生株，前6h差别不明显，711后差别明显加大；仍可在绵羊血平板上发生β溶血；对SUMECs的侵袭率降为0.57％；对小鼠的毒力显著降低，其LD50大于108CFU/ml。用Red系统快速成功的获得了侵袭相关基因ibeA被完全敲除且不带卡那霉素抗性基因的大肠杆菌，为深入研究大肠杆菌减毒活疫苗奠定了基础.

目录

文摘

英文文摘

前言

符号及缩略语说明

上篇 文献综述

第一章 禽致病性大肠杆菌的研究进展

1 病原学

2 流行病学

3 致病机理

4 禽致病性大肠杆菌的毒力因子

参考文献

第二章 Red重组技术研究进展

1 Red重组系统的结构

2 Red系统的重组机制

3 Red系统的同源重组过程

4 Red重组系统的应用

5 Red重组技术的应用前景

参考文献

第三章 细胞凋亡的研究进展

1 细胞凋亡的一般概念

2 细胞凋亡的生物学特征

3 细胞凋亡的分子调控机理

4 细胞凋亡的检测方法

5 细胞凋亡与医学的关系

参考文献

下篇 研究内容

第四章 华东地区鸭源APEC的分离鉴定与系统进化群分析

1 材料与方法

2 结果

3 小结与讨论

参考文献

ISOLATION,IDENTIFICATION AND PHYLOGENETIC GROUP OF APEC FROM DUCKS IN EASTERN CHINA

第五章 华东地区鸭源APEC非侵袭相关的16个毒力基因的检测

1 材料与方法

2 结果

3 讨论与小结

参考文献

KETECTION OF 16 NON-INVASION ASSOCIATED VIRULENCE GENES OF APEC FROM DUCKS IN EASTERN CHINA

第六章 华东地区鸭源APEC侵袭相关基因的检测

1 材料与方法

2 结果

3 讨论与小结

参考文献

DETECTION OF INVASION-ASSOCIATED GENES OF APEC ISOLATES FROM DUCKS IN EASTERN CHINA

第七章 核酸斑点杂交法检测鸭源APEC毒力相关基因

1 材料和方法

2 结果

3 讨论与小结

参考文献

DETECTION OF VIRULENCE-ASSOCIATED GENES IN APEC FROM DUCKS BY DOT BLOT HYBRIDIZATION

第八章 鸭源APEC分离株DE205B的主要特性研究

1 材料与方法

2 结果

3 讨论与小结

参考文献

STUDY OF MAINLY CHARACTERIZATION ABOUT THE ISOLATE DE205B OF APEC FROM DUCKS

第九章 鸭源APEC分离株DE205B侵袭相关基因IBEA的序列分析

1 材料与方法

2 结果

3 讨论与小结

参考文献

SEQUENCE ANALYSIS OF INVASION-ASSOCIATED GENE IBEA OF THE ISOLATE DE205B OF FPOM DUCKS

第十章 鸭源APEC分离株DE205B侵袭相关基因IBEA的缺失及主要生物学特性分析

1 材料与方法

2 结果

3 讨论与小结

参考文献

DELETION OF INVASION-ASSOCIATED GENE IBEA OF THE ISOLATE DE205B OF APEC FROM DUCKS AND ANALYSIS OF THE MAINLY BIOLOGICAL CHARACTERIZATIONS

全文总结

致谢

攻读博士学位期间发表及待发表的文章