“大团蜜露”桃雄性不育的细胞和生理特性研究

摘要

桃(Amygdalus persica L.)是自花结实的树种。但目前栽培的一些桃品种花粉败育,加之桃花粉发育期间异常高温导致花粉发育不良,造成授粉受精不良影响了桃的产量和品质。因此,为克服桃雄性不育给生产带来的影响和利用雄性不育资源在改善品质方面的潜在价值,本试验以桃雄性不育品种“大团蜜露”和可育品种“锦绣”为材料,开展了桃雄性不育的细胞和生理特性研究。首先在研究桃花粉适宜萌发条件基础上,对目前栽培桃品种的花粉量及其萌发特性进行了分析,鉴定了“大团蜜露”等一些品种的雄性不育性,并对其花粉败育的时期和特征进行了研究；其次,从亚细胞水平以及荧光物质的分布等方面研究了“大团蜜露”花粉败育的细胞学机制；另外从生理角度,分析了Ca2+及Ca2+-ATFase分布以及激素和多胺变化与其花粉败育的关系；最后结合桃设施栽培中的高温问题,研究高温对花粉育性影响及其机理。
　　 1.桃花粉萌发适宜培养基为10％蔗糖+0.1％硼酸+1％琼脂,培养条件为25℃下暗培养。桃花粉量、萌发率、可萌发花粉量及花粉管生长长度在基因型间存在明显的差异,其变化范围分别为0～3500粒/花药、0～89.33％、0～2696粒/花药和0.17～1.56mm,出现频率经正态分布检验表明均不符合正态分布。对上述各项因子分别进行了聚类分析,可萌发花粉量少且花粉管生长速度慢的品种占45.65％,其中“大团蜜露”,为无花粉类型的雄性不育品种。通过可育的蟠桃品种“玉露”和不育水蜜桃品种“大团蜜露”进行杂交,后代雄性可育植株与不育植株的比例符合1:1的规律,说明“大团蜜露”雄性不育性状是一个隐性纯合体。
　　 2.“大团蜜露”从花粉母细胞减数分裂到四分体小孢子从四分体中释放出来,与“锦绣”没有差异。“大团蜜露”桃的败育起始于单核小孢子早期,表现为小孢子发育缓慢、畸形,细胞质收缩,细胞核解体,逐渐解体成空壳,然后消失。
　　 3.在透射电镜下,“锦绣”小孢子发生和发育过程中,线粒体结构清晰,液泡膜完整,且含有丰富的内质网、核糖体和高尔基体等细胞器,在成熟的花粉内含有大量的淀粉粒；而“大团蜜露”在小孢子母细胞时期就出现包裹小孢子母细胞的胼胝质厚薄不均匀；在四分体小孢子时期内质网分布较少,之后小孢子液泡膜破损,质体、内质网等细胞器相继解体或退化,线粒体随之解体,最后细胞质开始收缩、解体,小孢子内仅留下细胞残骸。
　　 “锦绣”桃在四分体小孢子时期小孢子形成了良好的原外壁。在雄配子体发育过程中,其外壁迅速发育。在花粉成熟时,花粉壁由薄的内壁及由基足层、基柱棒、覆盖层共同组成的外壁构成；“大团蜜露”在四分小孢子时期胞内分布的细胞器少,形成不完整的原外壁,或质膜和原外壁分离等不良现象。在单核小孢子时期,外壁发育缓慢,壁上不能沉积孢粉素,形成了只有局部有基柱层的外壁,且较正常孢子的外壁薄；“锦绣”小孢子外壁的荧光物质随雄配子体的发育而逐渐增多,在单核小孢子后期,小孢子外壁上除萌发的孔沟外沉积了均匀的荧光物质。“大团蜜露”从单核小孢子产生后荧光没有明显增加,强度显著低于对照品种,随之出现变形和相互粘连等异常表现。
　　 “大团蜜露”和“锦绣”小孢子母细胞时期的绒毡层均表现出细胞质收缩,细胞间和内切相面形成了许多空腔,细胞内高尔基体和分泌小泡增多,内质网膨胀形成槽库结构；四分体时期,“锦绣”绒毡层内分泌小泡和槽库结构的内质网进一步增多,并向药室分泌大量的鸟氏体。而“大团蜜露”绒毡层细胞内产生了大量的小液泡,并吞噬细胞内含物；在小孢子刚形成时,“大团蜜露”与“锦绣”一样出现结构清晰的内质网、线粒体等细胞器.而后“锦绣”细胞质变得稀薄,细胞器逐渐解体,在小孢子发育后期,“锦绣”绒毡层细胞内仅有油体等结构,并呈极性分布。而“大团蜜露”绒毡层细胞内内含物丰富,细胞内分布有大量的质体和淀粉粒,呈现出延迟解体的特征。
　　 4.运用细胞化学定位法,对雄性不育的“大团蜜露”和可育的“锦绣”桃花药发育过程中Ca2+进行了定位。“大团蜜露”在小孢子母细胞膜表面积累的Ca2+沉淀颗粒明显比“锦绣”少.在四分体时期,“锦绣”小孢子表面积累了大量的Ca2+沉淀颗粒,而“大团蜜露”的Ca2+沉淀颗粒更多地分布在胼胝质以及小孢子的细胞质中。随着小孢子形成和进一步发育,在“锦绣”小孢子的液泡、内壁部位均积累了Ca2+沉淀颗粒,而“大团蜜露”小孢子中的Ca2+沉淀颗粒则更多地分布在细胞质以及一些细胞器上,然后小孢子开始收缩解体.说明“大团蜜露”小孢子中Ca2+的异常分布与其花粉败育有关。从小孢子母细胞开始,“锦绣”花药绒毡层Ca2+沉淀颗粒主要分布在径切向面和内切向面,并不断地向细胞间隙和药室分泌。随着小孢子的产生和发育,Ca2+沉淀颗粒分布的量逐渐增多,细胞内部也逐渐有Ca2+的分布。而不育“大团蜜露”小孢子产生之前,绒毡层中Ca2+沉淀颗粒明显比对照要少；小孢子产生后,绒毡层表面Ca2+分布较“锦绣”多。
　　 “锦绣”四分小孢子膜上分布着少量Ca2+-ATPase,少量分布在线粒体和小液泡膜上；随着小孢子产生和发育,小孢子细胞膜、内壁以及液泡膜和线粒体等细胞器膜上Ca2+-ATPase分布逐渐增多；随着花粉发育成熟,花粉内膜上Ca2+-ATPase分布减少,主要分布在细胞膜以及内壁上.而“大团蜜露”四分小孢子细胞膜没有Ca2+-ATPase的分布,随小孢子产生和发育质膜上依然未见Ca2+-ATPase黑色颗粒,在其小孢子解体过程中也没有Ca2+-ATPase的分布。“大团蜜露”从小孢子母细胞时期开始,在绒毡层细胞膜和液泡膜等细胞器分布有大量的Ca2+-ATPase,随小孢子产生和发育绒毡层中Ca2+-ATPase减少,随绒毡层解体而逐渐消失。Ca2+-ATPase在绒毡层的分布部位和数量与“锦绣”无明显差异。
　　 5.从花粉母细胞到花药成熟期,“大团蜜露”和“锦绣”花药中游离态、可溶结合态和束缚态多胺含量的变化都呈现先上升后下降趋势,游离态和束缚态多胺的最大值出现在单核期,而结合态多胺的峰值在四分体时期.从四分体至花药成熟期“锦绣”花药中游离态、结合态和束缚态多胺含量分别是“大团蜜露”的2.74～4.97、3.75～3.91和2.20～3.03倍。对不同类型的多胺含量比较发现,可育品种“锦绣”花药中游离态,结合态和束缚态Spd的绝对与相对含量都高于同形态的Put和Spm。
　　 从花粉母细胞到花药成熟期,“大团蜜露”花药中IAA含量持续下降,在单核花粉期和花药成熟期花药中IAA含量仅为“锦绣”同期的14.45％和17.38％；而“大团蜜露”花药中的ABA含量则平稳上升,在四分体和单核花药期,“大团蜜露”花药中ABA的含量分别是“锦绣”的3.08和3.79倍。
　　 6.对“锦绣”花芽进行高温处理,与对照相比,35℃高温处理1h对花粉量影响不显著,随着处理时间增加,花粉量、萌发率以及花粉管生长量显著下降,5h高温处理的花粉量仅为对照的1.9％,且基本不萌发；5h高温处理部分花粉母细胞减数分裂后不能形成正常的四分体,而形成二分体、三分体以及多分体.随着胼胝质的解体,出现了多核小孢子。高温处理后小孢子细胞质收缩解体,随后小孢子壁也解体；高温处理的花药壁细胞染色浅,绒毡层提前解体。说明绒毡层不能为小孢子的发育提供营养物质,使小孢子的发育受阻,造成小孢子降解。
　　 在花粉发育的早期即花粉母细胞和四分体时期,1h高温处理后花药中游离态和结合态Put、Spa和Spm含量持续升高,四分体时期后急速下降。3h和5h高温处理后的整个花粉发育期花药中游离态、可溶结合态和束缚态多胺含量逐渐减少,而0h和1h处理则呈现先升后降的变化趋势。在四分体和单核花粉期,0h处理花药中游离态和束缚态多胺含量分别是5h处理的3.39～6.34和3.53～4.36倍,Oh处理单核花粉期花药中结合态多胺含量为5h处理的5.59倍。在高温胁迫下,3h和5h花药中Sod和Put的绝对和相对含量都要高于Spm,表明Spm对高温的敏感及其对花粉发育的作用。
　　 从花粉母细胞到花药成熟期,随着35℃高温处理时间的延长花药中IAA含量呈现出下降的趋势,在单核花粉和花药成熟期5h高温处理花药中IAA含量仅为0h处理的12.4％和22.29％。ABA含量的变化呈现与IAA相反的趋势,在单核花粉期0h高温处理花药中ABA含量仅为5h处理的16.33％。
　　 综上所述,本研究从细胞形态、亚细胞水平、细胞化学和生理生化水平上对“大团蜜露”桃雄性不育机理进行了系统的研究,明确了“大团蜜露”花粉败育的时期和主要细胞学机制,探明了“大团蜜桃”雄性不育在细胞化学和某些生理生化方面的败育机理,为从分子水平来研究“大团蜜露”雄性不育的机理和人工调控育性的表达提供了理论依据.此外,探讨了高温对花粉育性的影响及其机理。