家蚕基因组中50-500nt非编码RNA的发现鉴定及表达谱研究

摘要

非编码RNA(non-coding RNA，ncRNA)是一类不编码蛋白质但有功能的RNA的总称，包括除开放阅读框外的其它所有RNA及mRNA前体中的内含子序列及基因间区序列。几乎所有生物体内都存在非编码RNA，它们通过RNA-DNA/染色质、RNA/RNA和RNA/蛋白质相互作用等方式参与到转录调节、染色体复制、RNA加工与修饰、mRNA的稳定性与翻译、以及蛋白质降解与转运等重要的生命过程中。新的ncRNA的发现和ncRNA功能的揭示将极大丰富人们对生命世界的认识，并对明确一些重大疾病的发病机制和设计新的治疗策略带来革命性的突破，同时对生物进化探索也具有重要意义。
　　 家蚕作为人类最早驯化的动物之一，具有重要的经济价值。同时作为鳞翅目的模式生物，在研究昆虫变态发育及农林业害虫防治中也发挥着重要的作用。2004年，以西南农业大学向仲怀院士乖夏庆友教授为首的科学家完成了对家蚕基因组全序列的测定，大大促进了我国家蚕基因组学的研究。利用家蚕基因组序列提供的信息，充分挖掘调控家蚕发育过程的关键基因，阐明调控家蚕发育过程的分子机制，进而利用转基因技术培育高产优质家蚕新品种，同时通过对发育过程基因表达调控的研究为鳞翅目害虫防治提供理论依据，已成为家蚕基因组学研究的重要内容。
　　 本研究在家蚕基因组测序完成的情况下构建家蚕50-500nt ncRNA文库，并对得到的新的ncRNA的时空表达模式进行研究，同时结合其宿主基因及上下游基因的表达模式预测ncRNA的功能，试图从基因组水平上探讨ncRNA可能参与的调控途径及发挥作用的方式，为揭示家蚕发育分子机制提供理论依据。本文主要结果如下：
　　 1．通过实验RNA组学的方法，构建了家蚕50-500nt ncRNA的cDNA文库，共测序列3027个，得到新的ncRNA194个。通过保守序列和二级结构特征分析，得到45个C/D box snoRNA，83个H/ACA box snoRNA，不具有明显结构特征的ncRNA58个，另外还得到C/D-H/ACA box杂合子snoRNA2个及新SRP RNA1个。
　　 2．除snRNA、tRNA、SRP外，家蚕新发现的ncRNA在一级序列上和其他物种同源性都很低。但8个C/D box snoRNA和36个H/ACA box snoRNA与其他物种snoRNA具有相同的功能元件。因此，共有141个新发现的ncRNA为家蚕所特有。
　　 3．通过基因组定位发现，家蚕新发现的ncRNA的产生方式多样。103个位于编码基因的内舍子区，80个位于基因间区，4个与编码基因的第一个或最后一个外显予重合，4个从编码基因内含子的互补链上转录出来，另外3个由预测的转座子区转录而来。
　　 4．家蚕ncRNA很少以基因簇的形式存在，除2个位于基因间区的基因簇外，其他ncRNA均单独存在或相距较远。内含子起源的ncRNA都遵循一个内含子编码一个ncRNA的基因组织形式，这和果蝇不同。内含子起源的snoRNA的宿主基因大部分都和核糖体加工及成熟相关，这和其他物种中的情况一致。
　　 5．通过对ncRNA的靶基因预测发现，家蚕ncRNA的靶基因种类多样。22个C/D和49个H/ACA box snoRNA可以指导rRNA和snRNA的27个2'O-核糖甲基化和72个假尿嘧啶化位点修饰，其中3个C/D box snoRNA指导3个tRNA的4个甲基化位点修饰。另外，两个C/D-H/ACA box杂合子snoRNA指导18S和5.8S rRNA的3个假尿嘧啶化位点修饰；3个C/D box snoRNA指导3个mRNA的修饰。
　　 6．利用表达芯片及Northern杂交的方法，得到了123个新的ncRNA在家蚕卵、幼虫、蛹和成虫中的表达谱。其中36个在家蚕不同虫态的表达量存在显著差异，且差异表达的ncRNA大部分在卵和成虫中表达量较高。在这36个差异表达的ncRNA中，不能归类的ncRNA占较大的比例。
　　 7．选取部分ncRNA对其在幼虫五个龄期和蛹期不同发育天数的表达进行研究。结果发现，Bm-86在五龄幼虫中表达量显著升高；Bm-51、Bm-86、Bm-152和Bm-160随化蛹的进行表达量有下降的趋势。
　　 8．位于内含子区的ncRNA大多与其宿主基因的表达模式一致，但在个别虫态不一致；从基因间区转录的ncRNA与上下游基因之间存在着正向或反向的关联；从正反义基因对上转录出的ncRNA与它们互补链上的基因也存在着复杂的关系，在家蚕某些虫态二者协同表达，但在另一些虫态不一致。