Bt毒素寡聚体形成与脂筏的关系以及钙粘蛋白的免疫检测技术探索

摘要

苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)是一类革兰氏阳性昆虫病原细菌，芽孢形成期其能产生具有特异毒性的杀虫晶体蛋白(Insecticidal Crystal Proteins,ICPs)。Cry1Ac毒素是苏云金芽孢杆菌产生的一种杀虫晶体蛋白，它能够在中肠上皮细胞形成孔洞，最终导致细胞肿胀破裂而死亡。脂筏是刷状缘膜囊泡脂双层内一个特殊的微区结构，此区域富含胆固醇、鞘脂类和糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚固蛋白，是细胞生物学活动的平台，在很多生物学活动中都起到十分重要的作用。CrylAc活化毒素单体和昆虫中肠上皮细胞刷状缘膜囊泡(BBMV)在37℃条件下孵育1h能够形成250kDa的Cry1Ac毒素寡聚体结构，此结构是昆虫膜穿孔的致死关键。而毒素寡聚体的形成是由于Cry1Ac毒素单体与BBMV上钙粘素受体的交互作用而形成的，之后形成的寡聚体再在氨肽酶受体的作用下与GPI-锚固蛋白结合，最终在GPI-锚固蛋白的作用下在细胞膜上形成穿孔导致细胞肿胀最终死亡。
　　 脂筏是BBMV上的特殊微区，离体BBMV与离体脂筏是否都能通过与Cry1Ac毒素单体孵育而形成寡聚体结构，本实验针对这一点重点进行了研究。Bt毒素对敏感和抗性棉铃虫品系的作用方式是否相同，抗性品系是否能形成寡聚体，不同鳞翅目昆虫形成寡聚体机制是否相同，这些是我们所要研究的主要问题。我们通过对棉铃虫敏感品系和抗性品系，菜青虫，二化螟，斜纹夜蛾这五种鳞翅目昆虫的研究来探讨这一问题，我们采用Western-blotting试验方法证明：Cry1Ac毒素寡聚体的形成与离体脂筏结构没有直接关联，离体条件下Cry1Ac毒素只能与BBMV孵育才能形成寡聚体结构，但脂筏结构必须保持其完整性。本试验通过使用胆固醇抑制剂甲基-β-环糊精和皂苷处理BBMV，离心从而去掉脂筏中的胆固醇，之后BBMV与Cry1Ac毒素孵育则寡聚体不能形成，说明脂筏完整性被破坏后不能行使其生物学功能；同时本实验还证实脂筏微区上GPI-锚固蛋白也是寡聚体形成的一个关键因素，PIPLC能够去除GPI锚固结构，用PIPLC处理BBMV使其去掉GPI-锚固蛋白后，寡聚体也不能形成。
　　 试验中我们还分别采用Dot-blotting, ELISA的方法检测棉铃虫抗性和敏感品系，二化螟，斜纹夜蛾中的钙粘蛋白。应用Dot-blotting和ELISA方法检测分别从定性和定量的角度对钙粘蛋白在昆虫中肠的存在情况进行分析，目的是探测一种田间抗性检测的简便方法。在Dot-blotting检测中，田间采集各单头棉铃虫之间并无明显差异，与室内敏感及抗性棉铃虫也无显著差异；在ELISA检测中，敏感品系的OD值略高于抗性品系的OD值，差异不显著，但二化螟和斜纹夜蛾的OD值远远高于棉铃虫两种品系，能明显区分。

目录

文摘

英文文摘

名词缩写

第一章 文献综述

1．脂筏的结构与功能

1.1 脂筏的结构与性质

1.2 脂筏的功能

1.3 脂筏与细菌毒素的关系

2. Bt毒素作用机理

2.1 Bt毒素简介

2.2 Bt杀虫活性物质

2.3 Bt毒素受体

2.4 BT毒素寡聚体形成机理与形成条件

3. Bt抗性机制与抗性克服办法

3.1 抗性机制

3.2 克服、延缓抗性办法

4．棉铃虫的发生、危害与防治现状

4.1 棉铃虫的发生及危害

4.2 棉铃虫的防治现状

5．本研究的目的意义

第二章 材料与方法

1．试验材料

1.1 供试棉铃虫

1.2 实验所需溶液配制

1.3 实验所用主要试剂

1.4 试验所用主要器材

1.5 试验所用仪器

2．试验方法

2.1 BBMV的制备

2.2 脂筏的制备

2.3 SDS-PAGE电泳

2.4 蛋白转印（Western-blotting）

第三章 结果与分析

1 脂筏与Cry1Ac毒素寡聚体形成的关系

1.1 棉铃虫敏感品系及抗性品系与Cry1Ac毒素寡聚体形成

1.2 菜青虫、二化螟、斜纹夜蛾BBMV和脂筏与Cry1Ac毒素寡聚体形成

1.3 脂筏破坏剂对Cry1Ac毒素寡聚体的影响

2 钙粘素蛋白在BBMV以及脂筏中的分布

2.1 Toxin-binding

2.2 钙粘素抗体检测

3 钙粘素蛋白的免疫检测

3.1 Dot-blotting

3.2 ELISA

第四章 讨论

1．寡聚体形成与钙粘素受体及氨肽酶受体的关系

2 脂筏完整性与寡聚体形成的关系

3．寡聚体形成与a-1螺旋结构及蛋白酶水解的关系

4．毒素单体主要结合受体

5．钙粘蛋白抗体检测

参考文献

全文总结

致谢

攻读学位期间发表的文章