外源亚精胺缓解黄瓜幼苗盐胁迫伤害的蛋白质组学及抗氧化机制研究

摘要

土壤盐渍化对农业生产的威胁是一个全球性的热点问题,是影响作物生长和产量的主要限制因素之一。黄瓜(Cucumis sativus L.)是世界性的重要蔬菜作物,也是我国设施栽培的主要的蔬菜作物之一,然而,由于黄瓜根系分布较浅,再生能力弱,对盐渍环境敏感。多胺(Polyamines,PAs)是生物代谢过程中产生的一类具有生物活性的低分子量脂肪族含氮碱,广泛作用于植物生长、形态建成、衰老和对环境胁迫的反应。近几年来,通过使用外源多胺类物质来调节和介导植物的耐盐性的研究越来越多。然而,关于多胺对蔬菜作物盐胁迫下蛋白质组影响的研究尚为空白。
　　 本文以耐盐性较弱的黄瓜品种‘津春2号’为试材,采用营养液栽培,通过叶面喷施外源1 mmol·L-1亚精胺(Spermidine,spd),测定了50 mmol·L-1 NaCl胁迫下黄瓜植株生长、活性氧代谢、活性氧清除酶活性和同工酶、蛋白质组、基因转录调控等方面的变化,研究了黄瓜可溶性蛋白变化、根系蛋白质组功能、mRNA转录水平以及活性氧代谢途径的变化与植株耐盐性的关系,探讨了外源Spd提高黄瓜植株耐盐性的分子生物学机制。主要研究结果如下:
　　 外源Spd调节盐胁迫下黄瓜幼苗生长和可溶性蛋白表达:NaCl胁迫下,第四片叶叶面积、地上部干重、根尖数、根长、根系干重和相对生长速率显著降低,外源Spd处理可明显缓解盐胁迫对黄瓜幼苗生长的抑制。与对照相比,盐胁迫提高可溶性蛋白含量,盐胁迫下喷施外源Spd处理进一步提高可溶性蛋白的含量。根系可溶性蛋白电泳分析表明,随着处理时间的延长,分子量约为67 kDa、29 kDa和16 kDa的可溶性蛋白表达量先增加后降低,各处理间差异不显著；与对照相比,盐胁迫下61.5 kDa、50 kDa、47 kDa和43 kDa蛋白表达量明显增强,外源Spd处理减弱了盐胁迫下61.5kDa、47 kDa和43 kDa蛋白的表达,50 kDa蛋白消失,推测这4种蛋白的变化可能与外源Spd缓解黄瓜幼苗盐胁迫伤害有关,外源Spd改变了盐胁迫下黄瓜根系可溶性蛋白的表达,提高植物对环境胁迫的适应,缓解盐胁迫对植物的伤害。
　　 黄瓜根系蛋白质双向凝胶电泳条件的筛选和优化:以根系为材料,采用改进的O'Farrell双向电泳系统,针对蛋白质提取方法、裂解液的组配、两性电解质范围和上样量的确定以及等电聚焦电泳参数等,筛选出适合营养液栽培的黄瓜幼苗根系蛋白质分析的双向电泳系统,即以改良的三氯乙酸/丙酮沉淀法提取根系蛋白质样品,经裂解液[7 mol·L-1尿素,2 mol·L-1硫脲,4％CHAPS,40 mmol·L-1 DTT,0.5％IPG缓冲液(pH4-7)]裂解后按800μg上样,梯度低压除盐进行第一向等电聚焦达到总时间电压积为35000 V·h,胶条平衡后进行第二向垂直的SDS-PAGE(12.5％)电泳,考马斯亮蓝染色后获得背景清晰、蛋白质分辨率较高的双向电泳图谱。
　　 外源Spd对盐胁迫下黄瓜幼苗根系蛋白质组影响的研究:比较对照和盐胁迫处理的根系2-DE图谱发现了34个差异表达蛋白点,29个蛋白点成功得到鉴定,其中21个蛋白点在盐胁迫下上调,spot12(液泡ATP合成酶催化亚基A)、spot13(热激蛋白70)、spot21(类GRP蛋白2)和spot34(线粒体苹果酸脱氢酶),表现出强烈的盐诱导特性；8个蛋白点在盐胁迫下下调,spot19(丙酮酸脱氢酶E1组分β亚基)、spot24(果糖二磷酸醛缩酶)和spot33(抗坏血酸过氧化物酶),表现出强烈的盐抑制特性。外源Spd处理改变盐胁迫介导的差异蛋白质的积累特性,27.59％的差异蛋白参与代谢、24.13％参与防御胁迫反应、17.24％是调节蛋白,其它为能量和转运、蛋白质生物合成和功能未知等蛋白。这些结果暗示:外源spd介导盐胁迫下黄瓜幼苗根系蛋白质的差异调节,可能通过修正代谢途径响应盐胁迫,增强黄瓜植株耐盐性。
　　 外源Spd对黄瓜幼苗盐逆境应答蛋白基因表达的影响:除apx和uq,其它8个候选转录子与对应的蛋白丰度表现出了一致的转录积累特性,且hsp70、apx、czsod、ela和cat-3对盐胁迫反应最大,推测这几个转录子与黄瓜植株耐盐性有关。除napod、uq和apx,其它7个候选转录子响应外源Spd积累特性与它们相应蛋白响应Spd的积累特征一致,且sams、napod和cat-3对外源Spd处理反应最大,推测外源Spd增强黄瓜植株耐盐性可能与这几个转录子关系密切。表明大多数候选蛋白转录积累特性与诱导蛋白积累特性一致,外源Spd从转录水平上调节了盐胁迫下差异蛋白的表达,增强黄瓜植株耐盐性。
　　 外源Spd对盐胁迫下黄瓜幼苗活性氧代谢的影响:NaCl胁迫下,叶片和根系自由基的产生速率、H2O2和MDA含量显著增加,POD和SOD活性提高。外源Spd处理进一步提高盐胁迫下黄瓜幼苗叶片和根系中POD和SOD的活性,同时降低自由基的产生速率、H2O2和MDA含量,在叶片中分别检测到5条POD同工酶、5条SOD同工酶和2条CAT同工酶条带,在根系中分别检测到7条POD同工酶、4条SOD同工酶和2条CAT同工酶条带,盐胁迫诱导了黄瓜幼苗POD和SOD同工酶的表达,但是抑制了根系CAT同工酶的表达；外源Spd进一步增强了盐胁迫下POD和SOD同工酶的表达,但对叶片和根系中CAT同工酶进行了差异调节.表明Spd促进短期盐胁迫下黄瓜幼苗抗氧化系统酶的活性和表达,保护黄瓜幼苗抵御氧化胁迫伤害。