内共生菌Wolbachia对灰飞虱的生殖调控作用及其与WO phage相互作用关系的研究

摘要

灰飞虱(Laodelphax striatellus)、白背飞虱(Sogatella furcifera)和褐飞虱（Nilaparvata lugens）是属于昆虫纲Insecta、半翅目Hemiptera、飞虱科Delphacidae的水稻害虫，通过直接刺吸和传播病毒对水稻生产造成很大影响。Wolbachia是广泛存在于节肢动物体内的一种共生细菌，可通过宿主卵的细胞质进行母系遗传，并以诱导胞质不亲和（cytoplasmic incompatibility, CI）、诱导雌性化(feminization)、诱导孤雌生殖（parthenogenesis induction, PI）和杀雄作用（male-killing）这四种方式调控其寄主的生殖以实现其在宿主种群中的稳定存在和扩散。
　　 噬菌体是以细菌为宿主的病毒，有高度的宿主特异性，是细菌遗传进化的重要推动力。WO phage是Shinjit和Masui(2000)在Teleogryllus taiwanemma的Wolbachia基因组中首次发现并命名的。WO噬菌体既能以溶原状态插入到其宿主的染色体中，又可以裂解状态自由存在于细胞质中，因此可能携带重要的基因到Wolbachia中或参与Wolbachia调控宿主生殖方式。本文以中国两个地理种群灰飞虱为实验材料，研究了共生菌Wolbachia对中国灰飞虱生殖作用的影响。同时本文以灰飞虱、白背飞虱、褐飞虱为实验材料，通过对Wolbachia的wsp基因和WO噬菌体的orf7基因进行序列分析以及对Wolbachia和WO噬菌体进行数量关系的研究，深入探讨了bacteriophageWO在其Wolbachia宿主中的的感染情况以及与Wolbachia的相互作用关系。
　　 本研究的主要内容以及取得的初步研究成果如下：
　　 1.为检验Wolbachia对中国灰飞虱生殖的影响，本研究以广西壮族自治区南宁市(NN)和云南省宁洱市(NE)两个地理种群为实验材料，通过四环素处理筛选到完全不感染Wolbachia的品系后再与感染品系进行杂交实验。结果发现，这两个地理种群灰飞虱中感染的Wolbachia都能够诱导高强度的胞质不亲和作用(CI)，表现为胚胎的死亡及产卵量的大幅度下降。
　　 2.本研究通过PCR检测编码WO噬菌体衣壳蛋白的orf7基因首次报道了在三种稻飞虱体内存在WO phage对Wolbachia的侵染，并通过分子克隆分析了WO phage的类型。结果表明，试验中20个稻飞虱中的Wolbachia普遍存在着WO phage的感染，感染率为47％～96％不等。对不同地理种群感染的WO phage的orf7基因序列分析可知共有三种不同类型的WO噬菌体，其序列分别登录到Genbank。
　　 3.通过对20个地理种群稻飞虱体内感染的Wolbachia wsp基因及WO phage的orf7基因进行克隆测序并进行系统发育分析，比较两个系统发育树的拓扑结构发现二者表现出很明显的不一致性，由此说明WO phage和Wolbachia两者的系统发育关系相关性并不明显；同时发现地中海粉螟和灰飞虱中感染的WO phage位于同一进化支内，说明WO噬菌体在不同宿主的Wolbachia之间可能发生了水平转移，由此可推断WO噬菌体可能会像其他胞外细菌的噬菌体那样参与促进Wolbachia的遗传进化。这是在稻飞虱体内对WO phage的首次报道和研究，为以后进一步深入研究奠定了基础。
　　 4.本研究设计特异性引物，利用real-time quantitative PCR技术检测了灰飞虱、白背飞虱、褐飞虱体内感染的Wolbachia和WO phage的绝对拷贝数，了解了Wolbachia和WO phage在三种稻飞虱体内的总体分布情况；另外还比较了不同日龄的灰飞虱雄虫体内Wolbachia和WO phage的数量以研究二者之间的关系，结果发现Wolbachia和WO phage在不同日龄的灰飞虱雄虫体内的数量变化趋势十分相似。这是到目前为止国际上首次利用实时定量PCR技术对灰飞虱体内的WO phage进行定量研究。

目录

文摘

英文文摘

第一章 文献综述

1 Wolbachia的研究进展

1.1 Wolbachia的的分布

1.2 Wolbachia的系统发育

1.3 Wolbachia的传播规律

1.4 Wolbachia对宿主生殖活动的调控

1.5 Wolbachia的基因组学研究

1.6 Wolbachia的检测技术

1.7 Wolbachia的应用前景

2 WOphage的研究进展

2.1 WO phage的分布及特征

2.2 WOphage的多样性

2.3 WOphage的基因组

2.4 WOphage与宿主Wolbachia的相互关系

3 实时定量PCR技术概述

3.1 实时定量PCR技术的发展

3.2 实时定量PCR定量DNA的方法

3.3 实时定量PCR技术的应用及其优缺

4 技术路线

第二章 Wolbachia对灰飞虱生殖调控作用的研究

1 材料与方法

1.1 供试昆虫

1.2 检测种群感染Wolbachia的情况

1.3 筛选100%不感染Wolbachia(U)的灰飞虱种群

1.4 种群内遗传杂交实验

1.5 数据的统计分析

2 结果与分析

2.1 Wolbachia在灰飞虱种群中的感染情况

2.2 种群内杂交实验结果

3 讨论

第三章 WO噬菌体在稻飞虱中的检测

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.2 稻飞虱总DNA的提取

1.3 PCR检测

1.4 琼脂糖凝胶电泳检测

1.5 PCR产物纯化

1.6 连接反应和转化

1.7 质粒的提取

1.8 测序

2 结果与分析

2.1 不同地理种群稻飞虱中WO噬菌体的感染情况

2.2 Wolbachia和wO噬菌体的类型分析

3 讨论

第四章 WO噬菌体与其宿主Wolbachia的协同进化关系研究

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.2 稻飞虱总DNA的提取

1.3 PCR检测

1.4 琼脂糖凝胶电泳检测

1.5 PCR产物纯化

1.6 连接反应和转化

1.7 质粒的提取

1.8 测序

1.9 序列分析

2 结果

2.1 测序结果

2.2 Wolbachia与WO噬菌体的系统发育关系分析

3 讨论

第五章 Real-Time PCR方法检测WO phage和Wolbachia的菌量

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.2 总DNA的提取

1.3 PCR检测飞虱体内的Wolbachia和WO噬菌体

1.5 PCR产物纯化

1.6 连接反应和转化

1.7 质粒的提取

1.8 标准曲线的制定

1.9 实时定量PCR

2 结果

2.1 三种稻飞虱体内Wolbachia和wO噬菌体的菌量

2.2 不同日龄灰飞虱体内Wolbachia和WO噬菌体的菌量

3 讨论

全文总结

参考文献

学术论文发表情况

致谢