藤稔葡萄花发育相关基因的克隆及表达分析

摘要

为解释植物开花这一复杂生命现象，近百年来科研工作者对成花机理进行了大量积极的探索。花发育的研究从生理生化层次逐步深入到分子水平。植物成花分子机理已在拟南芥、金鱼草等模式植物上取得了重要进展，大量功能基因得到分离鉴定，形成了复杂而精确的遗传调控网络，其中FLOWERING LOCUS T、FLOWERINGLOCUS C、APETALA3、AGAMOUS是调控成花时间及植物花器官原基分化与发育的四个关键基因。不同种类植物中这四个基因的同源基因在序列特征、表达模式和功能上具有相对保守性和不同程度的差异性。果树成花分子机理的研究起步较晚，相对落后。本实验以藤稔葡萄（Vitis vinifera×Vitis labrusca‘Fujiminori’）为实验材料，克隆得到葡萄FLOWERING LOCUS T、FLOWERING LOCUS C、APETALA3、AGAMOUS四个同源基因的cDNA序列及这四个基因上游的启动子序列，并通过相关软件，对它们的结构和功能进行了分析。同时对这四个基因在葡萄花期不同阶段的表达特性进行了初步研究。以期为深入了解葡萄花形态建成过程，调控葡萄的开花结实提供分子生物学基础。主要研究结果如下：
　　 1.采用克隆红富士葡萄FLOWERING LOCUS T、FLOWERING LOCUS C、APETALA3和AGAMOUS全长编码区相同的引物，以藤稔葡萄花序的总RNA为模板，通过RT-PCR和3'RACE扩增得到这四个基因的cDNA序列。经过拼接得到藤稔葡萄FT基因cDNA序列长度为757 bp（GenBank登录号HM192810），包含一个完整的525 bp的开放阅读框，编码174个氨基酸残基。藤稔葡萄FLC基因cDNA序列长度为1038 bp（GenBank登录号HM192809），包含一个完整的632 bp的开放阅读框，编码210个氨基酸残基.藤稔葡萄AP3基因cDNA序列长度为1049 bp（GenBank登录号HM192808），包含一个完整的681 bp的开放阅读框，编码226个氨基酸残基。藤稔葡萄AG基因cDNA序列长度为1123 bp（GenBank登录号HM192807），包含一个完整的681 bp的开放阅读框，编码226个氨基酸残基。同时对这四个基因的生物信息学特性进行了初步分析。
　　 2.通过基于热不对称交错PCR的基因组步移法从藤稔葡萄中获得FLOWERING LOCUS T同源基因上游核酸片段长度为1605bp，包含有基因区域135bp，实际的启动子区域长1470 bp（GenBank登录号HM192806）。获得的FLOWERING LOCUS C同源基因上游核酸片段长度为1788bp，包含有基因区域90bp，实际的启动子区域长1698 bp（GenBank登录号HM192805）。获得的APETALA3同源基因上游核酸片段长度为1143 bp，包含有基因区域82 bp，实际的启动子区域长1061 bp（GenBank登录号HM192804）.获得的AGAMOUS同源基因上游核酸片段长度为1254 bp，包含有基因区域122 bp，实际的启动子区域长1132 bp（GenBank登录号HM192803）。经Plantcare在线预测表明这4个片段均含有启动子的特定结构及多个转录因子结合位点。
　　 3.以藤稔葡萄为材料，研究了FLOWERING LOCUS T、FLOWERING LOCUS C、APETALA3和AGAMOUS基因在葡萄花期的表达规律，结果表明，FT基因的表达量在藤稔葡萄整个花期稳步下降，但花前急剧上升，尤其是开花当天表达量达到最高值。FLC的表达量与FT相反，呈现较明显的先升后降的趋势。AP3在花期各阶段的表达量整体水平均不高，并呈缓慢下降的趋势。AG也呈现较明显的先升后降的趋势，在花前几天持续高表达。

目录

文摘

英文文摘

缩略词（ABBREVIATION）

引言

第一章 文献综述

1 葡萄成花相关基因研究进展

1.1 高等植物花发育的过程

1.2 编码花发育程序的基因

1.3 葡萄成花过程

1.4 葡萄花发育相关同源基因研究动态

1.5 小结

2 植物启动子研究进展

2.1 植物启动子结构与特征

2.2 植物启动子分类

2.3 启动子克隆方法

第二章 藤稔葡萄花发育相关基因的克隆与生物信息学分析

摘要

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

2 结果与分析

2.1 总RNA提取

2.2 葡萄花发育相关基因克隆

2.3 葡萄花发育相关基因生物信息学分析

3 讨论

第三章 藤稔葡萄花发育相关基因启动子的克隆

摘要

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

2 结果与分析

2.1 启动子克隆

2.2 序列分析及顺式元件预测

3 讨论

第四章 藤稔葡萄花发育相关基因花期表达分析

摘要

1 材料与方法

1.1 植物材料

1.2 主要试剂及仪器

1.3 实时荧光定量PCR体系的建立

1.4 数据分析

2 结果与分析

2.1 目的基因与内参基因引物扩增特异性验证

2.2 熔解曲线分析

2.3 葡萄花发育相关基因在藤稔花期的表达分析

3 讨论

全文结论

创新点

参考文献

附录

致 谢