丙烯酰胺对雄性动物生殖及成体干细胞的毒理学研究

摘要

目前,已知丙烯酰胺(Acrylamide)是一种二类致癌物质,并具有神经毒性、遗传毒性和生殖毒性。在瑞典科学家公布油炸、烧烤和烘焙类食品中含丙烯酰胺后,其公共卫生安全问题开始备受关注。
　　 丙烯酰胺职业性接触主要见于生产聚丙烯酰胺等的合成过程；丙烯酰胺是生产和合成聚丙烯酰胺过程中形成的一种中间化学物质,广泛应用于饮用水净化、城市污水和工业废水处理、油井工艺、建筑行业、造纸工业、饲料加工,土壤稳定剂以及化妆品、日用化学品添加剂、生物工程学试验等,同时,它还存在于烟草燃烧的烟雾中(这证明它能在生物原料的加热过程中形成).
　　 日常生活中,丙烯酰胺可见于使用化妆品、吸烟、经高温加工处理的淀粉类食品及饮用水中。丙烯酰胺可通过皮肤、口腔或呼吸道进入生物体内在,一旦进入体内,它可以快速分布于全身的组织中。孕妇接触丙烯酰胺,其可以通过血液进入胎儿.雄性动物摄入一定量丙烯酰胺可影响生殖能力。2010年3月,欧洲化学品管理局(ECHA)在高度关注物质(SVHC)清单中新增了一项物质,即丙烯酰胺。
　　 近几年,关于丙烯酰胺毒性机制的探讨不断深入,其生殖毒性的研究需要进行更大范围的研究和论证,本试验以大鼠为模式动物研究其体内生殖毒性,以大鼠和五指山小型猪骨髓间充质干细胞为细胞模型研究其体外细胞毒性,并探讨丙烯酰胺的生殖毒性和细胞毒性机制。
　　 1、口服丙烯酰胺对大鼠生长发育及生殖的影响
　　 本试验首先研究丙烯酰胺对雄性大鼠的生长发育与生殖毒性作用。选30只21日龄断奶未成熟SD雄性大鼠,随机分为3组。处理组Ⅰ和处理组Ⅱ分别通过自由饮水方式口服5mg/kg/d和10mg/kg/d的丙烯酰胺溶液8周,对照组口服蒸馏水.分别在第4周和第8周时对日增重、体重、脏器重等指标进行检测,并做睾丸和附睾及各脏器的组织形态学观察；在第8周时,同时检查附睾尾精子密度和精子顶体形态。结果显示,两处理组大鼠体增重显著低于对照组(P<0.05)；至试验结束时,睾丸、附睾发育受到影响；处理组Ⅱ大鼠附睾尾部精子密度显著低于对照组(P<0.05),处理组Ⅰ与对照组差异不显著(P>0.05)；睾丸出现不同程度的病理变化,曲细精管内生精细胞发生部分缺失。试验表明,丙烯酰胺可阻滞大鼠生长,影响性器官发育,对生精小管和间质细胞产生毒性作用而导致雄性大鼠附睾尾部精子密度降低。
　　 2、口服丙烯酰胺对大鼠生殖毒理机制的研究
　　 为进一步探讨丙烯酰胺的雄性生殖毒性机理,本试验对亚慢性染毒处理组I(5mg/kg/d)和处理组Ⅱ(10 mg/kg/d)的大鼠进行血清总睾酮测定,对睾丸和附睾病理组织切片形态学、免疫组织化学进行分析,计算处理组与对照组单位面积内的间质细胞数目,应用TissueGnostics全景组织体细胞定量分析仪对病理组织免疫组织化学图片做定量分析,对处理组与对照组大鼠附睾内sGCα1蛋白表达做全组织分析扫描。结果显示,丙烯酰胺亚慢性处理组Ⅱ中大鼠血清中总睾酮含量与对照组相比显著升高(P<0.05)；曲细精管周围间质细胞增生异常,与对照组相比差异显著(P<0.05),处理组Ⅰ与其它两组相比差异不显著；处理组Ⅱ中大鼠病理睾丸组织内间质细胞sGCα1蛋白表达量低于对照组,而sGCβ1表达量无明显差异；各组附睾全景组织体扫描分析结果显示,各组间附睾中sGCα1与sGCβ1表达量无明显差异,但是附睾头、尾部sGCα1表达强度较体部强烈。试验表明,丙烯酰胺的生殖毒性作用机制可能是通过NO/sGc/cGMP通路中的sGC蛋白,影响大鼠睾丸生精小管内紧密连接结构,使生精细胞发生缺失,从而导致精子密度降低；同时sGC异二聚体在睾丸和附睾内的差异性表达暗示二者在精子发生与类固醇激素合成过程中起着不同的生理作用。
　　 3、丙烯酰胺对大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化能力的影响
　　 为研究丙烯酰胺对大鼠骨髓间充质干细胞的细胞毒性作用,本试验从1月龄SD大鼠股骨、胫骨中分离、纯化出大鼠骨髓间充质干细胞,并通过成骨分化和细胞表面抗原进行鉴定。丙烯酰胺处理组细胞在基础培养基中添加0、5、100、300、1000μM浓度的丙烯酰胺,连续培养8天,观察丙烯酰胺对细胞形态变化,应用CCK-8法检测绘制细胞生长曲线,计算细胞增殖抑制率。在成骨分化21天过程中添加0、5、25、100、200、300μM浓度的丙烯酰胺,茜素红、碱性磷酸酶染色检测丙烯酰胺对成骨分化的影响。试验结果表明,丙烯酰胺可导致大鼠骨髓间充质干细胞形态发生改变,浓度为5、100、300、1000μM的丙烯酰胺对细胞生长的抑制率分别为7.69％、30.77％、53.85％和100％；对照组、5、100、300μM丙烯酰胺处理组大鼠骨髓间充质干细胞细胞倍增时间分别为:72、79.7、88.1和111.2小时。随丙烯酰胺浓度增大细胞成骨分化受抑制程度明显,碱性磷酸酶表达量降低且极显著(P<0.01)。表明丙烯酰胺抑制大鼠骨髓间充质干细胞增殖及其向成骨分化。
　　 4、丙烯酰胺对五指山小型猪骨髓间充质干细胞细胞增殖毒理的机制研究
　　 为研究丙烯酰胺对骨髓间充质干细胞增殖毒性的作用机制,本试验从6日龄五指山小型猪股骨中分离、纯化骨髓间充质干细胞,并通过成骨、成脂肪分化进行鉴定。丙烯酰胺处理组在基础培养基中添加0、50、100、500、1000μM的丙烯酰胺,处理1小时后,检测细胞中活性氧(ROS)与总谷胱甘肽过氧化物酶含量。连续处理3天后,观察细胞形态,应用微丝绿色荧光探针检测细胞骨架变化,同时提取RNA,检测细胞骨架actin基因表达变化。结果显示:丙烯酰胺处理组细胞内ROS含量随丙烯酰胺浓度升高而升高,500、1000μM处理组与对照组相比差异显著(P<0.05)；总谷胱甘肽过氧化物酶含量降低,与对照组相比差异显著(P<0.05)；丙烯酰胺500、1000μM处理组细胞骨架内微丝发生重排,细胞形态变圆,微丝缩短；定量PCR结果显示1000μM组细胞骨架actin基因表达量下调显著(P<0.05)；丙烯酰胺50、100μM处理组的上述检测指标与对照组相比差异不显著(P>0.05)。试验表明,高浓度丙烯酰胺可致五指山猪骨髓间充质干细胞形态发生变化,并影响其活性氧代谢,细胞骨架缩短,从而对细胞增殖能力产生影响。
　　 综上所述,体内试验表明,丙烯酰胺可阻滞断奶期大鼠生长,致使大鼠体重日增重下降。丙烯酰胺可引起大鼠附睾尾部精子密度下降,可能是丙烯酰胺通过NO/sGC/cGMP通路作用,影响大鼠睾丸生精小管紧密连接结构,致使生精小管内生精细胞发生耗竭,间质细胞增生与大鼠体内激素升高可能机体内精子发生过程中的代偿作用；体外试验结果表明,丙烯酰胺中、高剂量处理组细胞内ROS累积,细胞骨架微丝变短,导致细胞增殖能力降低。碱性磷酸酶活性降低,细胞形态发生改变,成骨分化受到抑制。