黄曲霉毒素B1和脱氧雪腐镰刀菌烯醇诱导锦鲤原代肝细胞凋亡机制的初步研究

摘要

霉菌毒素(Mycotoxin)是由霉菌产生的有毒次级代谢产物,各种饲料原料及成品都可能发生霉变而遭受霉菌毒素的污染。黄曲霉毒素B1(AFB1)是迄今为止人类所知的毒性最强的物质之一,可能对动物机体造成严重的伤害。脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)又名呕吐毒素,是一种全球性的谷物污染物,DON的毒性较弱,但污染范围和含量远超过其他毒素。根据对中国饲料及原料中霉菌毒素的调查发现,DON的阳性检出率为93.0％,平均值为1140 mg·kg-1,检出率远高于其他霉菌毒素。AFB1的毒性最强,DON的污染范围最广,但目前的研究主要集中在一种毒素对动物机体的影响,多种霉菌毒素间的相互作用机制报道较少,临床上两种毒素共同作用于动物机体的现象广泛存在,两者之间对动物机体影响的相互关系显得十分重要。且AFB1和DON对肝脏都具有明显的毒性作用,本试验选用锦鲤原代肝细胞,研究AFB1和DON单独和联合作用下,对锦鲤肝细胞形态学变化、凋亡率、线粒体跨膜电位的变化及凋亡通路相关基因表达的影响,初步探讨AFB1和DON诱导锦鲤肝细胞的作用机制,为深入研究AFB1和DON的毒性机理奠定基础。
　　 试验一:
　　 本试验将处于对数生长期的锦鲤原代肝细胞分别用10和20 ng·mL-1AFB1,125、250、500、1000和2000 ng·mL-1 DON以及10+125、10+250、10+500、20+125、20+250和20+500 ng·mL-1的AFB1+DON(培养基中的毒素终浓度)进行处理。12 h后,用倒置显微镜观察细胞的形态学变化,流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果显示:随着毒素浓度的增加,对细胞密度及生长状态的影响增强；随着DON浓度的增加,凋亡率逐渐增加；联合毒素组,在AFB1存在的条件下,随着DON浓度的增加,锦鲤肝细胞凋亡率逐渐增加。
　　 试验二:
　　 本试验将处于对数生长期的锦鲤原代肝细胞分别用10和20 ng·mL-1 AFB1,125、250、500、1000和2000 ng·mL-1 DON以及10+125、10+250、10+500、20+125、20+250和20+500 ng·mL-1的AFB1+DON(培养基中的毒素终浓度)进行处理,JC-1染色,用流式细胞仪检测线粒体跨膜电位。结果显示:与对照组相比AFB1试验组线粒体跨膜电位变化差异不显著,随着DON浓度(0-500 ng·mL-1)的增加线粒体跨膜电位逐渐降低,AFB1+DON试验组,在AFB1存在的条件下,随着DON浓度的增加,线粒体跨膜电位变化逐渐降低,且与DON单独试验组相比线粒体跨膜电位变化下降显著。
　　 试验三:
　　 本试验将处于对数生长期的锦鲤原代肝细胞分别用125、250、500和1000ng·mL-1DON以及10+125、10+250、10+500、20+125和20+250 ng·mL-1的AFB1+DON(培养基中的毒素终浓度)进行处理,作用12h后,提取总RNA,逆转录后进行荧光定量PCR。结果显示:随着DON浓度的增加,Bcl-2/Bax数值逐渐降低,在500 ngmL-1时达到最低值,1000 ng·mL-1时略有上升；AFB1+DON试验组,在AFB1存在条件下,随着DON浓度的增加,Bcl-2/Bax数值逐渐降低,在10+500 ng·mL-1的AFB1+DON时达到最低值,且与DON单独作用相比Bcl-2/Bax下降显著。