甲基对硫磷降解菌Sphingopyxis sp.DLP-2的生物学特性及Tnmpd的克隆和功能鉴定

摘要

有机磷农药是一类应用范围广泛、高效广谱的杀虫剂，为农业增产增收带来保障的同时，也带来了一系列环境问题。污染环境的微生物修复因具有无二次污染等优点而得到广泛的关注。
　　 本文从分离甲基对硫磷降解菌着手，进而研究其生物学特性、降解特性、基因和基因簇的克隆分析及水平转移现象的验证，旨在为有机磷农药的微生物降解提供理论依据。
　　 采用富集培养法从农药厂废水处理池的活性污泥中分离到一株甲基对硫磷降解菌 DLP-2。经形态特征、生理生化特征及16S rRNA基因序列相似性比较，初步将其鉴定为Sphingopyxis sp.(GenBank Accession N0.JF833116)。菌株DLP-2最适生长条件为：pH7.0，温度30℃。菌株DLP-2降解甲基对硫磷的最适条件为：pH7.0，温度30℃。与菌株的最适生长条件相一致。该菌在12 h内对50 mg·L-1 Mp的降解率达99％以上。但当其浓度达到100 mg·L-1时，仅可将MP降解为对硝基苯酚(PNP)，可能由于累积的PNP对其有毒害作用所致。DLP-2对MP的降解与接种量呈正相关。DLP-2菌株对乙基对硫磷和辛硫磷降解效果达80％以上，对毒死蜱和杀螟硫磷降解效果为50％以上，对杀扑磷、甲基异柳磷和三唑磷降解能力较弱，其降解率低于20％。
　　 通过PCR的方法，从菌株DLP-2中克隆出完整的甲基对硫磷水解酶基因mpd，在线比对序列相似性表明其与已报道的mpd和mph基因同源性达到99％。将其基因构建到表达载体pET29a，并在E.coli BL21(DE3)中进行表达，得到了分子量符合预期大小的表达产物(35 KDa)。
　　 通过PCR的方法，从菌株DLP-2中扩增出包含mpd基因在内的基因簇Tnmpd，大小为4552 bp。通过在线进行序列比对分析，其与已报道的Tnmph基因序列相似性为99％(GenBank accession No.EF463103)。该基因簇包括mpd基因及其上下游各一个典型的移动元件IS6100，据此推测mpd基因可能具有在菌株之间进行水平转移的能力。
　　 为了验证mpd基因是否具有水平转移的能力，我们将 Tnmpd连接到自杀性质粒pJQ200SK上，通过三亲结合，Tnmpd成功转移到受体菌Pseudomonas putida KT2440的染色体上，并使其具有了降解甲基对硫磷的能力。该结果对 Tnmpd的水平转移能力进行了验证。并为其在基因强化生物修复有机磷污染环境中的应用提供了理论依据。