围产期奶牛外周血液学及免疫相关细胞因子和TLR-4基因表达规律的研究

摘要

围产期是奶牛管理上的一个重要阶段，其管理水平直接影响到产后的繁殖和泌乳性能。奶牛围产期外周血白细胞功能发生一定程度的紊乱，其主要表现为淋巴细胞、中性粒细胞免疫功能减弱。目前对该阶段的研究主要集中在能量负平衡以及饲料添加剂等方面，而对于该阶段奶牛机体血液学指标及机体免疫力相关基因表达研究国内还存在空白，尤其是围产期阶段淋巴细胞、中性粒细胞相关调节基因表达的研究还未见报道。在分析和综述了先前研究的基础上，本研究以产前21天、14天、7天、产犊当天0天、产后7天、14天和21天7个时间点的外周血淋巴细胞、中性粒细胞为研究对象，通过RT-PCR、FCM和WB等手段对调节外周血中性粒细胞(PMN) TLR-4通路(TLR-4，CD14，MD-2)基因、淋巴细胞中CD3+、CD4+、CD8+及IL-2和IL-4细胞因子的表达来进行了研究，以期通过阐明围产期外周血中淋巴细胞、中性粒细胞及机体免疫力相关基因的表达规律，为以后改善该阶段奶牛的免疫状况提供理论基础和科学依据。
　　 主要研究结果如下:
　　 1奶牛围产期血液学的研究
　　 通过对外周血中各种细胞数量以及血浆中GPT，GOT和GSH-Px酶的活性分析表明:白细胞总数在产前7天，14天显著低于其它组(P＜0.05）;淋巴细胞从产前21天（3.34±0.13×109）/L逐渐降低至产后7天（2.41±0.13×109）/L，随后又逐渐升高;相对于吞噬细胞和中性粒细胞在产犊期达到（1.45±0.02×109）/L和（3.12±0.26×109）/L峰值，而嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞在产犊时却仅为（0.13±0.06×109）/L和（0.05±0.03×109）/L，为7组中的最低值。
　　 从测定的结果可以看出，产前外周血红细胞数量逐渐增加，产犊日达到峰值(6.04±1.02×1012)/L后逐渐降低，产前与产后差异显著(p＜0.05)。血红蛋白的含量在产前21天逐渐升高，产犊时达到最高水平，产后较低。血小板在产前21天逐渐增加，产犊后迅速降到最低值，之后逐渐升高。
　　 血浆中酶活性分析表明，除GPT在围产期差异不显著（P＞0.05）外，GOT和GSH-Px两种酶的活性在一定时期内存在显著差异，特别是反映氧化应激的GSH-Px其产后第7天时达到峰值，极显著高于其它组(P＜0.01)。
　　 2围产期外周血T淋巴细胞亚群及细胞因子表达的研究
　　 通过应用流式细胞术测定CD3+、CD4+、CD8+及实时荧光定量(RT-PCR)检测细胞因子IL-2，IL-4 mRNA表达分析表明:血液中CD3+的比例在产前21天内占（50.8±4.61％），产后14天内降低到（33.3±3.53％），两者差异极显著（P＜0.01）;CD4+在产前21天内保持较高水平（21.38±0.65％），产后21天内维持在较低水平（6.89±0.32％），与产前差异极显著(P＜0.01); CD8+的比例在产犊时达到最高水平（16.91±2.02％），差异显著（P＜0.05）;而与机体免疫力直接相关的CD4+/CD8+的比值呈现产前高而产后低的趋势，产前CD4+/CD8+＞1，产后CD4+/CD8+＜1。IL-2 mRNA的表达量在产后0～14天内下调，之后上升。IL-4mRNA的表达量产犊期达到最高随后下降，至第7天降至最低。
　　 3围产期血液PMN中TLR-4途径mRNA表达量的研究
　　 TLR-4途径(TLR-4、CD14、MD-2)是调节PMN识别病原菌的主要通路。该通路上基因表达的趋势直接反映机体的免疫状态。本研究应用RT-PCR分析了围产期外周血PMN细胞中TLR-4途径(TLR-4、CD14、MD-2)的mRNA表达，结果发现:PMN中TLR-4途径基因(TLR-4，CD14，MD-2)中，TLR-4和CD14在产后14天内mRNA的表达量下调，而MD-2仅在产后7天下调。
　　 4围产期TLR-4蛋白的表达量分析
　　 为进一步研究围产期间TLR-4的变化，我们主要应用变性聚丙烯酰胺和Western Blot技术分别检测了PMN中总蛋白和影响PMN关键基因的TLR-4蛋白质的表达情况，研究发现:(1)血液PMN中总蛋白含量在不同阶段差异不显著（P＞0.05），可能与维持细胞活性的主要蛋白表达恒定有关，所表达的蛋白分子量在55～70 KDa之间占据表达优势。(2)产后14天内TLR-4蛋白表达显著降低。
　　 通过以上研究我们可以得出以下结论:
　　 1奶牛围产期阶段外周血中白细胞数量（淋巴细胞、中性粒细胞、吞噬细胞等）及GOT、GSH-Px酶活性存在一定程度的变化;
　　 2淋巴细胞的T细胞亚群CD3+、CD4+、CD8+的数量和比例发生变化，尤其是产后CD4+/CD8+的比例较低，CD4+/CD8+＜1。
　　 3外周血中淋巴细胞中IL-2、IL-4的mRNA表达量发生改变。其中IL-2在产后14天内下调差异极显著，IL-4在产后7天下调差异极显著。
　　 4调节PMN紊乱的TLR-4途径基因(TLR-4，CD14，MD-2) mRNA表达量在产后一定时间内下调，其中TLR-4，CD14产后14天内下调，MD-2产后7天内下调。

目录

声明

论文说明

摘要

引言

第一篇 文献综述

第一章 奶牛围产期免疫状态的研究

1 围产期定义

2 围产期期间奶牛机体变化的研究

3 围产期免疫功能下调发生的原因

4 奶牛围产期免疫功能下调的预防及调节

5 依据免疫力进行选育的研究

参考文献

第二章 奶牛中性多形核细胞的分子调控与免疫的研究进展

1 PMN的生物学特征

2 PMN的生成

3 PMN的凋亡

4 PMN表面的受体

5 乳房和血液中的PMN的功能活性

6 影响围产期PMN功能的因素

7 展望PMN的研究前景

参考文献

第三章 TLR-4基因在奶牛上的研究进展

1 LPS/TLR-4细胞信号传导通路的研究

2 TLR-4作为调节PMN的靶基因药物的研究

3 TLR-4作为抗病性选育靶基因的研究

4 结论

参考文献

第二篇 试验研究

第一章 奶牛围产期血液学的研究

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

4 结论

参考文献

第二章 外周血中CD3、CD4、CD8及细胞因子IL-2、IL-4mRNA表达量的研究

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

4 结论

参考文献

第三章 围产期期间外周血PMN中TLR-4途径mRNA表达量的研究

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

4 结论

参考文献

第四章 围产期PMN中TLR-4蛋白的表达分析

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

4 结论

参考文献

全文结论

主要创新点

缩略词(Abbreviation)

攻读学位期间发表的论文

致谢