小麦叶片中一种与Rubisco大亚基降解相关的蛋白酶的生化特性研究

摘要

在前期研究中发现了小麦叶片中一种能够降解1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Rubisco)大亚基的蛋白酶紧密结合于Rubisco的基础上，本文以小麦3E158(Triticumaestivum L.cv.3E158)叶片为实验材料，通过天然梯度凝胶电泳后切胶回收得到的Rubisco，应用SDS-PAGE分离鉴定蛋白质方法，主要研究了结合于Rubisco上的该蛋白酶在Tris-HCI和其他缓冲介质体系中降解Rubisco大亚基的生化特性，并建立了以人工合成底物(Boc-LRR-AMC)快速测定该蛋白酶活性的荧光检测方法。其主要研究结果简述如下：
　　 1.在Tris-HCI缓冲液中电泳后切胶回收的Rubisco的大亚基降解
　　 小麦粗酶提取液经过天然梯度(5％-10％)凝胶电泳后，通过切胶回收含有Rubisco的凝胶我们得到了纯度很高的Rubisco全酶。将这种Rubisco全酶在Tris-HCl缓冲液中40℃下保温处理1h后，就能发现产生了Rubisco大亚基的降解片段；当保温时间达到6h左右，至少可以观察到4条清晰的降解蛋白条带，其中包括有Zhang等(2007)在小麦暗诱导叶片粗酶提取液和叶绿体裂解液中发现的51 kDa降解片段；而这种Rubisco大亚基的降解现象可以通过预先对切胶回收得到的Rubisco煮沸3分钟后消除。因此，我们确认在切胶回收得到的Rubisco中存在一种能将Rubisco大亚基降解成数条不同大小片段的蛋白酶，而且该蛋白酶紧密结合于Rubisco全酶中。研究还发现，这种蛋白酶在10-45℃内都具有酶活性，在30℃以上时随着温度的升高，该酶活性逐渐增强，最适温度在40℃左右，60℃时该蛋白酶仍可以将Rubisco大亚基降解。不同蛋白酶抑制剂对该蛋白酶的影响研究结果表明，丝氨酸型蛋白酶抑制剂AEBSF和胰蛋白酶抑制剂能够显著抑制该蛋白酶的活性，而PMSF和几种金属蛋白酶抑制剂能部分抑制该蛋白酶的活性，因此，该蛋白酶是一种需要金属离子的丝氨酸型蛋白酶。
　　 2.在其他缓冲介质体系中电泳后切胶回收的Rubisco的大亚基降解
　　 切胶回收的Rubisco在四种缓冲介质体系中的大亚基降解研究结果表明，该蛋白酶的活性在pH4到9之间受pH的影响不大，但在同种pH条件下的不同缓冲介质中该酶催化Rubisco大亚基的降解情况却迥然不同。以pH同为7.0时的四种缓冲介质：Tris-HCl，Na2HPO4-NaH2PO4，Na2HPO4-KH2PO4，Na2HPO4-Citric acid为例，在Tris-HCl缓冲液中该蛋白酶催化大亚基的降解作用最为显著，而在另外三种缓冲介质中大亚基几乎不发生降解。在pH7.0的缓冲介质Na2HPO4-NaH2PO4中，通过延长反应时间或者升高反应温度也无法使Rubisco大亚基产生于在pH7.0的Tris-HCl缓冲液中一样明显的降解蛋白条带。在使用pH7.0的Na2HPO4-NaH2PO4进行粗酶液提取和切胶回收得到的Rubisco溶液中，再加入不同浓度的Tris-HCl(pH7.0)保温处理后，出现有轻微的Rubisco大亚基的降解片段，但是没有发现与上述用Tris-HCl(pH7.0)缓冲液提取和切胶回收的Rubisco一样明显的大亚基降解片段，因此，我们认为，Tris-HCl对该蛋白酶还是具有一定的激活作用，但是这种激活作用可能被Na2HPO4-NaH2PO4中的Na+抑制作用所抵消。接着，我们用Tris-HCl(pH7.0)缓冲液提取和切胶回收的Rubisco全酶中加入不同浓度的NaCl进行研究，结果发现当加入的Na+浓度小于100mmol·L-1时，Rubisco大亚基还是出现了比较明显的降解条带，但是，这种降解现象随着Na+浓度的升高而逐渐减弱；当Na+浓度达到300 mmol·L-1时，基本看不到大亚基被降解的蛋白片段。由此，我们可以确定在Rubisco大亚基的降解作用中，高浓度的Na+起抑制作用。另外，根据该蛋白酶是一种丝氨酸型蛋白酶的实验结果，本文还创建了一种以人工合成底物(Boc-LRR-AMC)快速检测该蛋白酶活性的荧光检测方法，并就抑制剂、pH和Na+浓度对该蛋白酶活性影响三个方面进行了研究，将该蛋白酶催化Boc-LRR-AMC水解的实验数据量化，其结果与大亚基降解的电泳分析图谱情况基本吻合。该方法可以简便、快速地运用于该蛋白酶的纯化和检测中。