生防多粘芽孢杆菌SQR-21的定殖与诱导植物系统抗性研究

摘要

近年来，随着化学农药大量使用造成的环境污染，农药残留问题的凸现，人们把目光投向了生物防治，生防菌剂、微生物有机肥等生防产品得到了广泛的使用并展现出良好的应用前景。多粘芽孢杆菌由于能分泌多种抗菌素，是生防菌家族中的重要成员之一。本文研究了生防多粘芽孢杆菌SQR-21在根际的定殖、诱导植物获得系统抗性及其它生防机制，为其在生物防治领域的进一步应用奠定基础。
　　 从一株野生型芽孢杆菌中分离获得了质粒pPZZ84，首先根据rep基因的保守序列，先扩得rep基因片段并测序，然后根据质粒的环状特征，在rep基因片段的两侧反向设计引物扩得质粒的剩余片段并测序，最后拼接获得了质粒pPZZ84的全序列(6817bp)。序列分析表明pPZZ84的大小为6817bp，G+C的含量是36.7％。ORF预测结果表明，pPZZ84含有7个ORF阅读框，其中ORF5和ORF7分别编码Rap(天门冬氨酸磷酸酶)和Rep蛋白，ORF1和ORF2编码2个未知蛋白，ORF3，4和6在目前的NCBI蛋白数据库中尚未找到同源性蛋白序列。荧光定量PCR结果表明pPZZ84在宿主的拷贝数为46。
　　 为研究生防芽孢杆菌SQR-21在土壤和植物组织的定殖情况，分别以pUB110和pPZZ84的rep基因，km抗性基因和组成型启动子PHapⅡ分别构建了生防芽孢杆菌gfp标记载体pHapⅡ(6838bp)和pHapⅢ(7835bp)。转化结果表明pHapⅡ能在枯草芽孢杆菌，短小芽孢杆菌，解淀粉芽孢杆菌及多粘芽孢杆菌的一些野生型菌株中转录复制，而pHapⅢ只能在短小芽孢杆菌中复制、表达。质粒稳定性研究结果表明，pHapⅡ在枯草芽孢杆菌SQR-9和短小芽孢杆菌JK-001内有较高的稳定性，在无抗生素压力下连续培养96代后，质粒丢失率小于10％;而在多粘芽孢杆菌SQR-21中的稳定性较低，质粒在无抗生素压力下连续培养96代后基本完全丢失。标记菌株SQR-21在黄瓜根际及根表的定殖研究发现生防菌株SQR-21/pHapⅡ能在根表定殖，接种4天后，数量达到5.85 log CFU·g-1 root，8天后数量增加到6.88 log CFU·g-1root。然后数量稍有减少，第12天至第16天，数量维持在5.9 log CFU·g-1 root。标记菌株SQR-21/pHapⅡ在根际土壤中的数量低于根表的数量，从第4天至第16天数量约为4.5 log CFU·g-1 root。试验也发现标记菌株SQR-21/pHapⅡ也能在植物根内少量定殖约2 log CFU·g-1 root。
　　 生防菌诱导植物系统抗性是其生防机制的重要组成部分。以黄瓜-炭疽病为研究对象，研究了多粘芽孢杆菌SQR-21，蕈状芽孢杆菌BmJ和莫哈韦芽孢杆菌203-7对黄瓜的诱导抗性。研究表明经生防菌SQR-21，BmJ和203-7处理的黄瓜其病变组织的产孢率较对照分别减少69％，42％和58％。生防菌能够快速的诱导黄瓜植株中抗病相关蛋白基因PR1-1a，PR-3，APOX的表达，生防菌处理的黄瓜侵染叶片的PR1-1a在第2天都得到了高效的表达，而对照处理的黄瓜侵染叶片的PR1-1a基因直到第3天才有了少量的表达。BmJ处理的黄瓜侵染叶片的PR-3在第1天就有了显著的表达，其他处理虽然在第2天也有了一定的表达，但是和BmJ的相比差异显著，在第2天，BmJ处理的PR-3表达量是对照处理的5倍。在病原菌侵染后第1天203-7处理的黄瓜侵染叶片的APOX表达量与其他处理差异显著。
　　 经生防菌诱导的植物病变组织的β-1，3-葡聚糖酶和几丁质酶活性得到了一定的提高。BmJ处理的黄瓜侵染叶片内几丁质酶活最高，相对于无菌水处理提高了96％;生防菌203-7和SQR-21处理的几丁质酶活较无菌水处理也分别提高了65％和72％。203-7处理的黄瓜侵染叶内β-1，3葡聚糖酶活最高，相对于无菌水处理提高了163％;生防菌BmJ和SQR-21处理的β-1，3葡聚糖酶活较无菌水处理也分别提高了127％和118％。
　　 通过荧光定量PCR的方法研究了生防菌处理对病原菌Glomerella cingulata var.orbiculare在黄瓜病变周围组织的定殖的影响，结果表明炭疽病病原菌侵染3天后，经SQR-21处理的叶片病变周围组织中炭疽病病原菌DNA浓度是对照处理三分之一，203-7处理的叶片病变周围组织中病原菌DNA浓度为对照的二分之一，而BmJ处理的叶片病变周围组织中炭疽病病原菌DNA浓度为对照为三分之二。从3dpi到11dpi，对照处理的叶片病变周围组织中病原菌DNA浓度增加了28倍，而生防菌处理的只增加了21倍小。显微镜观察发现了SQR-21处理的黄瓜其病原菌侵染后附着胞和刚毛数量的小于对照，该结果表明SQR-21处理的黄瓜能抑制病原菌孢子的萌发和孢子的形成。生防芽孢杆菌SQR-21还能诱导黄瓜产生酚类抗毒素物质及抑制细菌的群体感应。
　　 以拟南芥-灰霉的植物病害体系为模式，研究了拮抗菌处理对拟南芥发病率的影响以及SQR-21诱导植物系统抗性所依赖的激素信号途径。结果表明，对照处理的发病率高达80％左右，SQR-21及BmJ处理次之，分别为65％和54％。经生防菌SQR-21诱导的叶片其病变组织的面积较对照处理的小得多。SQR-21能够诱导相关激素途径的基因表达并减少植株的发病率，当JA途径缺失时，SQR-21处理的拟南芥植株诱导调控受到抑制，不仅影响了PDF1.2的表达，对SA途径相关基因PR-1的表达也产生了一定的抑制作用。但是在JA途径存在的情况下，SQR-21处理的拟南芥在受病原菌侵染时能够较对照处理更快的表达PDF1.2基因，表达量也高于对照。根据以上结果推测SQR-21诱导植物系统抗性是依赖茉莉酸途径，不受水杨酸途径和乙烯途径的调控。

目录

声明

摘要

符号与缩略语说明

第一章 文献综述

1 生物防治的发展简史

1．1 生物防治的概述

1．2 生物防治的发展历史

2 病原菌-植物-生防菌三者之间的关系

2．1 病原菌

2．2 植物

2．3 生防菌

3 生防芽孢杆菌的研究进展

3．1 生防芽孢杆菌的定殖研究

3．2 生防芽孢杆菌的抗菌物质研究

3．3 生防芽孢杆菌的诱导抗性的研究

4 植物炭疽病炭疽菌属(Colletotrichum)的研究进展

5 研究背景与技术路线

5．1 研究背景

5．2 技术路线

第二章 生防芽孢杆菌gfp标记载体的构建及定殖研究

第一节 野生型短小芽孢杆菌质粒pPZZ84的测序及生物信息学分析

引言

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

第二节 生防芽孢杆菌gfp标记载体的构建及SOR-21的定殖研究

引言

1 材料与方法

2 结果和分析

3 讨论

4 本章小结

第三章 生防芽孢杆菌SQR-21，BmJ和203-7诱导黄瓜对炭疽病的系统抗性研究

引言

第一节 生防芽孢杆菌SQR-21，BmJ和203-7对黄瓜炭疽病原菌(Glomerella cingulata var． orbiculare)在黄瓜叶面定殖的影响

1 材料与方法

2 结果和分析

3 讨论

第二节 生防芽孢杆菌SQR-21，BmJ和203-7诱导黄瓜获得系统抗性研究

1 材料与方法

2 结果和分析

3 讨论

4 本章小结

第四章 生防芽孢杆菌SQR-21对激活拟南芥抗病激素免疫调控的研究

前言

1 材料与方法

1．1 供试材料

1．2 植物组织RNA的提取和cDNA的合成

1．3 PCR及引物

1．4 植株的培养条件，生防菌剂的处理以及病原菌侵染条件

1．5 生防菌菌悬液和病原菌孢子悬液的制备

1．6 化学诱导

2 结果和分析

2．1 SQR-21对拟南芥野生型Co1-1／灰霉的诱导抗性研究

2．2 SQR-21对拟南芥不同激素诱导系统突变子的诱导抗性研究

3 讨论

4 本章小结

参考文献

全文结论

创新点

附录

攻读学位期间已(待)发表的论文

致谢