上海地区猪源大肠杆菌和沙门氏菌的耐药性及耐药基因的研究

摘要

本试验通过对上海地区四个区县猪场的大肠杆菌和沙门氏菌进行耐药监测，不仅可以掌握耐药菌株和耐药基因的分布与变化趋势，探明耐药菌和耐药基因的演变机制与传播模式，对上海地区建立统一、规范的监测标准提供资料和依据，而且可以指导本地区的养殖业主的合理使用抗菌药物，减少抗菌药物耐药性的传播，确定遏制细菌耐药性传播措施的可靠性和有效性，帮助有关研究机构和制药公司有目的地开发新的抗菌药。
　　 1.大肠杆菌和沙门氏菌的分离培养与鉴定对从猪场采集的粪便样品通过选择性培养基选择培养，TSI试验及细菌自动鉴定仪进行鉴定，结果表明:414个样品中分离鉴定出371株大肠杆菌，35株沙门氏菌，分离率分别为为89.6％，10.9％。大肠杆菌的分离率显著高于沙门氏菌。
　　 2.大肠杆菌和沙门氏菌的耐药性分析猪场分离的大肠杆菌和沙门氏菌对13种养殖业中常用的抗菌药物的进行耐药性的研究，耐药结果表明:大肠杆菌对氨苄西林、大观霉素、复方新诺明、强力霉素、四环素、磺胺异噁唑耐药率较高，最低的耐药率也达到了74.7％。大肠杆菌的多重耐药率达到了95.82％，大部分集中在6～10种抗菌药物的耐药;沙门氏菌对氟苯尼考耐药率较高，但对多粘菌素E则较为敏感，其中对多粘菌素E的耐药率仅为11.4％。
　　 3.实时荧光定量PCR对产ESBLs的大肠杆菌基因型的检测方法的建立采用临床和实验室标准化研究所(CLSI)推荐的ESBLs初筛、确证试验方法（微量肉汤稀释法），对从上述实验分离到的大肠杆菌进行ESBLs的检测，通过NCBI上公布的ESBLs的四个基因型TEM、CTX-M、SHV、OXA的序列设计荧光探针的引物，建立起一种快速检测ESBLs的荧光定量PCR的方法。结果显示，选择0.5μmol/L作为最佳引物浓度，选择0.1μmol/L作为探针的最佳浓度。在重复性试验中四个基因型的五个不同稀释浓度的变异系数均为超过1.5％，说明重复性较好。本试验的扩增检测限为101拷贝/μ/L，远远高于普通PCR的104拷贝/μ/L，标准曲线的线性相关系数R2＞0.99。本试验可用ESBLs四个基因型的检测。
　　 4.沙门氏菌分子分型的研究应用Ribo-PrinterMicrobial Characterization System(RP)PVUⅡ对上述分离得到的35株沙门菌进行DNA指纹图谱的测定，并且统计实验菌株相互之间的相似性关系。35株沙门氏菌中，检测出1株猪霍乱沙门氏菌，1株阿格纳沙门氏菌，检测率分别为2.9％，分别只有一个RP型;15株肠炎沙门氏菌，检测率为42.9％，被分成5个RP型;18株鼠伤寒沙门氏菌，检测率分别为51.4％被分为6个RP型。

目录

声明

摘要

缩略符号

引言

第一章 文献综述

1 细菌的耐药性的研究进展

2 细菌耐药性的分类

2．1 天然耐药性

2．2 获得耐药性

2．3 多重耐药和交叉耐药多重耐药性

3 细菌耐药性的现状

4 细菌耐药性产生的原因

4．1 细菌本身的因素

4．2 抗菌药物的使用不合理

4．3 医学新技术的应用

5 细菌耐药性产生的机制

5．1 细菌产生破坏药物结构的灭活酶

5．2 抗菌药物结合靶位改变

5．3 细菌的主动外排机制

5．4 生物被膜的形成

5．5 阻碍抗菌药的渗透

5．6 耐药基因的转移

6 控制细菌耐药性的措施

6．1 加强兽药的管理

6．2 开展动物源性细菌耐药性的监测

6．3 加强饲养管理，减少抗菌药物的使用，合理使用抗菌药

6．4 开发新药及中药的使用

7 ESBLs历史演化及重要特征

7．1 ESBLs历史演化

7．2 ESBLs的基因分型

8 PCR检测技术研究进展

8．1 普通PCR检测

8．2 荧光定量PCR检测

9 分子分型技术研究和应用现状

10 结束语

参考文献

第二章 大肠杆菌和沙门氏菌的分离培养与鉴定

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 方法

2 结果与分析

2．1 选择性培养基分离结果

2．2 TSI试验结果

2．3 大肠杆菌和沙门氏菌的分离率

3 讨论

参考文献

第三章 大肠杆菌及沙门氏菌的耐药性分析

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 试验方法

2 结果

2．1 大肠杆菌的耐药结果

2．2 沙门氏菌的耐药结果

3 讨论

参考文献

第四章 实时荧光定量PCR对产ESBLS的大肠杆菌基因型的检测方法的建立

1 材料和方法

1．1 菌株及药品

1．2 试剂

1．3 仪器

1．4 方法

2 结果

2．1 ESBLs的表型筛选和确证试验结果

2．2 标准品建立的结果

2．3 特异性评价的结果

2．4 实时荧光定量PCR体系优化结果

2．5 标准曲线的建立

2．6 重复性试验

2．7 敏感性试验

2．8 产ESBLs的大肠杆菌基因型的检测结果

3 讨论

参考文献

第五章 猪源沙门氏菌分子分型的研究

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 方法

2 结果

3 讨论

参考文献

全文结论

致谢