猪卵巢组织差异表达基因的筛选及相关基因EGR4、Lhx8和NOBOX的特性研究

摘要

猪繁殖性状一直是当前国内外研究的热点和难点。我国的太湖猪是世界产仔数最多的猪种，为了阐明太湖猪的高繁殖性能机制，本研究采用基因芯片技术对二花脸和皮特兰猪卵巢组织进行mRNA表达谱分析，筛选与繁殖性能相关的差异表达基因，利用实时荧光定量PCR对关键差异基因进行了验证。选取差异表达基因EGR4作为进一步研究的对象，通过RACE方法克隆了该基因的序列，并以各种生物信息学软件对序列进行了相关预测分析;利用半定量PCR方法分析了EGR4基因在猪各种组织中的表达谱;以实时荧光定量PCR和免疫组织化学方法对EGR4基因在不同生长时期的卵巢组织、不同发育时期的卵泡组织做了表达分析和猪卵巢组织中的定位分析;以猪卵泡颗粒细胞为实验材料，用RNAi方法敲减EGR4，利用流式细胞术、real-time RT-PCR、Western blot等方法检测阻抑该基因对猪卵泡颗粒细胞的作用及其分子机制。此外，对生殖细胞特异性转录因子NOBOX和Lhx8的研究做了进一步的补充，采用实时荧光定量PCR方法分析了NOBOX和Lhx8基因在不同生长时期的卵巢组织、不同发育时期的卵泡组织的表达特点;利用荧光素酶的活性分析，研究了NOBOX的核心启动子，以及Lhx8蛋白对NOBOX的启动子活性的影响。
　　 主要研究结果如下:
　　 1.为了研究太湖猪的高繁殖性能机制，采用基因芯片技术筛选二花脸和皮特兰猪卵巢组织中的差异表达基因。结果表明:在二花脸与皮特兰猪卵巢组织中筛选到差异基因有1060个，其中上调基因有487个，下调基因有573个。对差异表达基因GO分析发现379、211、84个差异基因分别获得生物过程、细胞组分及分子功能的分类注释，其余为功能未知基因。通过KEGG pathway分析有120个基因参与50个基因通路，如MAPK信号通路、凋亡通路等。同时，荧光定量PCR验证了关键基因在两个猪种的卵巢组织中的表达，差异趋势同芯片结果一致。
　　 2.用电子克隆和RACE方法克隆了猪EGR4基因的cDNA序列，并做预测分析，结果表明:猪EGR4基因有两个剪接体，序列长度分别为2484bp和2226bp。借助生物信息学网络资源与软件预测发现:猪EGR4基因5'UTR的长度为166bp，3'UTR为533bp，剪接体1的开放阅读框为1770bp，编码589个氨基酸，剪接体2的开放阅读框为1512bp，编码503个氨基酸;EGR4基因包括2个外显子和1个内含子，和其它哺乳动物的结构一样;编码的蛋白质没有疏水区，不是分泌性蛋白，且未发现跨膜区，定位于细胞核，含有三个锌指结构域，是一种转录因子，具有DNA结合活性，参与基因转录调控。
　　 3.用半定量PCR、real-time RT-PCR和免疫组织化学方法检测EGR4的表达特点，结果表明:EGR4基因在猪大脑、小脑、下丘脑、垂体和卵巢组织中大量表达，输卵管中微弱表达，而在其它组织中不表达;总EGR4和剪接体1的表达趋势相似，中卵泡中的表达量显著高于小卵泡。EGR4在猪卵巢组织中的各个卵泡阶段均有表达，在原始和初级卵泡中，EGR4主要在卵母细胞中表达，而颗粒细胞中只有微弱表达;腔前卵泡中，EGR4在颗粒细胞中的表达加强;有腔卵泡中，EGR4依旧定位在卵母细胞和颗粒细胞中，此时卵泡内膜细胞中也有表达。随着卵泡的发育EGR4所起的作用越来越广泛，说明在猪卵泡发育、卵泡选择和排卵过程中起重要作用。
　　 4.为了研究EGR4基因在猪卵泡颗粒细胞中的作用，本研究从猪卵巢卵泡(3-5mm)内分离颗粒细胞(pGCs)进行体外培养，采用RNAi技术“沉默”猪EGR4基因，检测阻抑该基因对猪卵泡颗粒细胞生长和相关细胞因子的影响。结果表明:RNA干扰EGR4后，其mRNA和蛋白水平均下调，即成功“敲减”猪颗粒细胞中的EGR4基因。阻抑该基因对颗粒细胞的凋亡没有影响，但Bax的表达上调， Bcl-2的表达不受影响。阻抑该基因后，参与雌二醇和孕酮合成关键酶P450arom的表达量上调，而P450scc的表达不变。此外阻抑EGR4基因后，EGR1和EGR3的mRNA水平出现了显著的下降，EGR2的mRNA水平不变。
　　 5.利用real-time RT-PCR方法检测生殖细胞特异性转录因子NOBOX和Lhx8的表达特点，结果表明:NOBOX和Lhx8基因均在出生2d的猪卵巢组织中表达量最高，在25d、75d中呈急剧下降趋势;在猪卵巢组织中不同发育时期的卵泡中，NOBOX和Lhx8在中、大卵泡中的表达量高于小卵泡。结果说明NOBOX和Lhx8在个体发育初期，卵泡发育过程中起着重要作用。
　　 6.利用在线软件预测分析猪NOBOX基因上游2300bp序列，结果发现该序列有5个潜在的核心启动子区域，分别位于+3～-47bp，-90～-140bp，-240～-290bp，-248～-298bp和-732～-782bp，在-350～-498bp处有一个CpG岛，将上游1000bp长的序列进行转录因子结合位点分析，有93个位点，暗示这些序列在NOBOX基因的表达中可能作为顺式作用元件发挥调控作用。荧光素酶的活性分析发现:在猪肾细胞中，NOBOX的缺失启动子NP3(-495～+183)的活性最高，NP6(+37～+183)的活性最低，基本没有启动子活性。为了研究Lhx8蛋白对NOBOX的调控作用，我们在猪肾细胞中转染Lhx8的真核表达载体。当猪肾细胞过表达Lhx8蛋白，NOBOX的缺失启动子NP1(-858～+183)活性比阴性对照组显著升高，而其他缺失启动子的活性没有显著变化，说明Lhx8通过NOBOX启动子上-858～-641区域参与NOBOX基因的调控。

目录

声明

论文说明

摘要

缩略语中英文对照(Abbreviation)

引言

第一章 文献综述

1 哺乳动物卵泡发育的研究

2 繁殖相关的转录因子的研究进展

2．1 EGR4的研究进展

2．2 Lhx8和NOBOX的研究进展

3 研究的目的和意义

参考文献

第二章 二花脸与皮特兰猪卵巢组织差异基因的筛选及差异基因EGR4的研究

实验一 二花脸与皮特兰猪卵巢组织差异基因的分析

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

参考文献

实验二 猪EGR4基因的克隆与序列分析

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

实验三 猪EGR4基因的表达分析

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

参考文献

实验四 猪卵泡颗粒细胞中阻抑EGR4基因对相关基因的影响

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

参考文献

第三章 Lhx8调控NOBOX启动子的研究

实验五 Lhx8和NOBOX在卵巢组织的表达分析

1 材料与方法

2．结果与分析

3 讨论

参考文献

实验六 Lhx8对NOBOX启动子的调控

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

参考文献

全文结论

创新点

附录一 主要溶液的配制

附录二 芯片分析中与繁殖性状相关的差异表达基因

附录三 猪EGR4基因完整的cDNA序列

附录四 猪NOBOX基因启动子序列

致谢