副猪嗜血杆菌的分离鉴定及其MLST分型研究以及aroA基因自杀性质粒的构建

摘要

副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis，Hps)是引起Glasser病的病原菌，主要引起猪的多发性浆膜炎、心包炎、关节炎、脑膜炎、支气管炎和败血症等。该菌是一种NAD依赖、不运动的革兰氏阴性细小杆菌，属于巴斯德菌科(Pastteurellaceae)嗜血杆菌属(Haemophilus)。随着我国规模化猪场的发展，Glasser病有着愈发严重的趋势，已成为很多猪场保育仔猪发病率和死亡率提高的重要原因之一，给养猪业造成严重损失。
　　 本研究主要分3部分进行:
　　 1.为了检测Hps在广东省各地区的感染情况，并对发病猪场的疫情进行治疗和控制，本研究从广东12个地区的14个规模化猪场中，于疑似患有Glasser病的猪体内分离病料，带回实验室后采用划线接种TSA固体培养基(NAD+)方法分离病原菌，并观察菌落形态、菌体形态、染色特性等方面的基本特征，最终通过PCR扩增16SrRNA的方法鉴定出17株Hps，并采用KRG血清分型的方法对这17个分离株进行血清分型。结果发现广东采样的这10个地区的规模化猪场中普遍存在着Hps的感染和流行。血清分型研究结果发现广东地区流行的优势血清型为5型，共有8株，占菌株总数的47.0％;位于第二位的是血清型8型，共有5株，占总菌株数的29.4％。值得注意的是，以往的文献都报道8型为无毒株，而本试验中所有的分离株都来自于有Glasser病临床症状的猪体内的病变组织，因此本研究中分离到的血清8型菌株是否具有毒力需进一步研究证实。
　　 2.对广东地区副猪嗜血杆菌的21个分离株进行了MLST基因分型研究，结果显示，广东地区副猪嗜血杆菌的7个看家都有不同程度的变异，其中6pgd变异率最高，达到了100％，7个基因的平均变异率为52.4％，每个菌也都产生了新的ST型，变异率为77.3％。基因的平均距离为0.732，IA值为0.824，与以往的研究结果比较一致。对21株菌的等位基因型和ST型以及Hps MLST数据库中公布的116个ST型菌株进行BURST分析，结果发现，这21株菌被分成了10个类群，有几株菌与远在欧洲和美洲的分离株都有亲缘关系，甚至分离于同一个猪场同一头猪的分离株，基因型都存在差异，证明副猪嗜血杆菌不仅流行广泛，变异率也很高。最后对这21个菌株的MLST基因型和血清型进行了比较，结果显示该菌的MLST基因型和血清型没有直接的对应关系。
　　 3.副猪嗜血杆菌有15个血清型，不同血清型之间交叉保护力较差，而被强毒株感染后康复的猪只却能获得针对大部分血清型Hps的抵抗力。为了保留强毒株较强的免疫原性，但同时又降低其毒力，通过基因敲出的方法使Hps强毒株的毒力基因或者代谢基因失活，从而使强毒株致弱，并用该毒力致弱株免疫猪群，将能获得较好的保护力。为了实现这一目的，本研究通过一系列克隆的方法构建了Hps H10株aroA基因的自杀性质粒pEMAaroA，为后续的Hps H10株aroA基因敲出奠定了基础。

目录

声明

摘要

缩略语及符号

1 病原学

2 病理学

3 毒力因子

3．1 外膜蛋白(Outer Membrane Protein)

3．2 神经氨酸酶(Neuraminidase)

3．3 三聚体自转运蛋白(Trimeric Autotransporters，VtaA)

3．4 细胞致死性肿胀毒素(Cytolethal Distending Toxins，Cdt)

3．5 脂多糖(Lipooligosaccharide)

4 诊断方法

4．1 病原菌的分离

4．2 抗体诊断

4．3 免疫组织化学技术(Immunohistochemical diagnosis，IHC)

4．4 分子生物学手段鉴定

5 分型

5．1 血清分型

5．2 多位点酶电泳(MEE)图谱分型法

5．3 基因分型

6 免疫和防治

第一章 副猪嗜血杆菌的分离与鉴定

1 材料和方法

1．1 主要试剂和仪器

1．2 溶液配制

1．3 病料来源

1．4 参考菌种

1．5 引物

1．6 病料采集和病原菌分离方法

1．7 革兰氏染色及镜检

1．8 副猪嗜血杆菌基因组DNA提取

1．9 病原菌的PCR鉴定

1．10 Hps的血清分型

2 结果与分析

2．1 临床表现和剖检变化

2．2 病原菌分离结果

2．3 革兰氏染色镜检结果

2．4 PCR鉴定结果

2．5 Hps血清分型的结果

4 讨论

第二章 副猪嗜血杆菌广东分离株MLST分型研究

1 材料和方法

1．1 主要试剂和仪器

1．2 溶液配制

1．3 参考菌种

1．4 引物

1．5 DNA电泳检测

1．6 DNA紫外分光光度法纯度测定

1．7 7个看家基因的PCR扩增及纯化

1．8 DNA测序与比对

1．9 统计分析

2 结果与分析

2．1 7个看家基因的PCR扩增结果

2．2 DNA测序与比对及ST分析

2．3 位点多态性分析

2．4 基于ST型的菌群分析

2．5 基因型和血清型的关系

3 讨论

第三章 aroA基因自杀性质粒的构建

1 材料与方法

1．1 质粒载体与菌株及其培养条件

1．2 酶、抗生素及试剂盒

1．3 主要仪器

1．4 培养基及抗生素、试剂的配置配制

1．5 引物

1．6 Hps的增殖及其基因组的提取

1．7 核酸物质的胶回收纯化

1．8 大肠杆菌感受态细胞的制备(氯化钙法)

1．9 连接产物的转化

1．10 质粒的制备

1．11 重组质粒的鉴定

1．12 菌株H10 PCR鉴定

1．13 菌株H10 aroA基因的鉴定

1．14 菌株H10 aroA基因前后壁的克隆与鉴定

1．15 中间转移质粒pMD18-T-ΔaroA的构建

1．16 重组自杀性质粒pEMΔaroA的构建

2 结果与分析

2．1 菌株H10的PCR鉴定

2．2 aroA基因前后臂片段的扩增

2．3 aroA基因前后臂片段的克隆与测序

2．4 中间转移质粒pMD18-T-ΔaroA的构建

2．5 自杀性质粒pMD18-T-ΔaroA的构建

3 讨论

参考文献

致谢