猪链球菌2型omp40基因功能研究及MRP与猪脑组织互作蛋白的筛选

摘要

猪链球菌(Streptococcus suis)是一种革兰氏阳性、溶血性兼性厌氧的球菌。可引起猪脑膜炎、关节炎、心内膜炎、支气管炎、多发性浆膜炎、脑炎、流产、败血症、脓肿及猝死;致人败血症、心内膜炎、脑膜炎，感染后遗症包括失聪和关节炎，严重的致人死亡，是一种重要的人畜共患病病原。根据其荚膜多糖抗原性的差异，分为33个血清型(1-31，33，1/2)。其中，2型(Streptococcus suis type2，SS2)是毒力最强、危害最严重、流行最广泛的血清型之一。1998年和2005年分别在我国江苏和四川暴发大规模SS2感染猪和人的公共卫生事件，临床上有高比例的病人出现中毒性休克综合征(STSS)，对养猪业及公共卫生均构成严重威胁，使得猪链球菌感染的相关研究受到高度关注。
　　 尽管致病微生物的致病机理各不相同，但是大部分致病菌致病都是利用粘附和侵袭机制穿透宿主细胞屏障，从而逃避机体清除机制。定植是病原菌致病力的关键，在细菌感染并引起疾病的早期发挥重要作用。病原菌的粘附能力是细菌成功定植的关键，黏附素是病原菌重要的毒力因子。链球菌的黏附素分为两大类，其中一类是MSCRAMMS（microbial surface cell recognition adhesion matrix molecule），能够粘附细胞外基质蛋白(ECM)以及细胞相关的整合素。这类黏附素一般是细胞壁锚定蛋白，含有LPXTG基序。已知的SS2 LPXTG锚定蛋白并不多，omp40和MRP在结构上均属于此类蛋白。
　　 本研究以SS2可能的毒力因子omp40和MRP为研究对象，通过Westernaffinity blot、基因缺失系统以及基因芯片研究了omp40在SS2致病中的作用。构建了猪脑组织cDNA文库，用酵母双杂交技术筛选MRP互作的宿主蛋白，以期更深入的了解MRP致病机制。
　　 1猪链球菌2型omp40基因的分布及克隆表达
　　 omp40基因是通过抑制性差减杂交（Suppression Subtractive Hybridization，SSH）方法鉴定的SS2可能的毒力基因，尚待深入研究。本文对omp40基因进行序列分析，克隆表达，并检测其在31株猪链球菌中的分布情况，以期进一步阐明其在SS2致病过程中的作用。结果显示:omp40开放阅读框为3000bp，编码1000aa，含有锚定基序LYXTG。Western blot证实其编码细菌胞壁蛋白。BLAST结果显示该蛋白与金黄色葡萄球菌的胶原蛋白结合蛋白Cna有共同的保守区域。在31株SS2菌株中，除了无毒株T15 omp40 PCR检测为阴性外，其他从病猪体内分离到的菌株均为阳性，而SS1、SS7、SS9、SS10、SS11、SS12均为阴性。配体印迹结合实验显示，omp40蛋白能与人胶原蛋白Ⅰ型结合，提示omp40在SS2的致病过程中可能发挥重要作用。
　　 2 omp40基因缺失株、互补株的构建及特性分析
　　 为了进一步研究omp40基因在SS2致病过程中的作用，利用温度敏感型穿梭自杀质粒pSET4s定点敲除SS2 ZY05719的omp40基因，构建了omp40基因缺失株Δomp40，并通过穿梭载体pSET2构建互补株CΔomp40。比较了各菌株在细胞粘附、生物被膜形成能力、毒力以及肢原蛋白粘附能力的差异。试验结果显示，缺失株乖互补株具有较好的遗传稳定性，缺失株对HEp-2细胞粘附能力下降30％，生物被膜形成能力是野毒株的0.65倍，在斑马鱼的感染模型中，毒力下降了4倍，对人胶原蛋白Ⅰ型的粘附显著下降，这些数据表明omp40与SS2的致病性相关。
　　 3猪链球菌2型OMP40介导感染小鼠脑微血管内皮细胞研究
　　 为了更好的了解OMP40在SS2感染过程中的作用，以小鼠脑微血管内皮细胞为研究模型，将SS2菌株ZY05719以及OMP缺失株分别与小鼠脑微血管内皮细胞共孵育，Trizol处理后小鼠全基因组表达谱芯片(Roche NimbleGen)分析。结果显示，两组不同处理的细胞中有30个基因的表达出现了差异，对这些基因分析显示，这些基因分属于多种功能范畴，包括免疫反应，炎症反应、信号转导等。其中，在omp40基因的存在下，部分趋化因子以及炎症因子的上调使得中性粒细胞趋化，内皮细胞通透性增加，利于细菌透过血脑屏障，表明omp40基因在SS2引发脑膜炎中起到了一定的作用。
　　 4猪链球菌2型纤连蛋白及胶原蛋白结合蛋白的筛选
　　 纤连蛋白及胶原蛋白是宿主体内的生物大分子，细胞外基质(ECM)的重要组成部分，是病原菌粘附作用的底物。将2-DE gels，Western affinity blot以及MS相结合，对SS2纤连蛋白及胶原蛋白结合蛋白进行筛选。结果显示:共有8个Collagen结合蛋白及15个Fn结合蛋白在转印后的PVDF膜上被鉴定出来。其中，有7个蛋白能够同时结合Collagen及Fn蛋白。SS2纤连蛋白及胶原蛋白结合蛋白的筛选为进一步研究SS2与宿主互作机制奠定了基础。
　　 5 MRP与猪脑组织互作蛋白的筛选
　　 分离纯化猪脑组织mRNA，以5'端生物素标记的Oligo(dT) primer为引物反转录后连接3种读码框的Adapter，层析柱分级纯化，通过BP重组反应分别构建3种读码框的cDNA入门文库，平均滴度为1.662×106 CFU/mL，文库总容量为6.648×106 CFU，平均插入片段＞1 kb，重组率为94％。将3种读码框的cDNA入门文库扩增后提取质粒，取等量的质粒通过LR重组反应将入门文库转换为三框表达文库，经测定滴度为1.78×106 CFU/mL，文库总容量为7.12×107 CFU，重组率为92％，平均插入片段＞1 kb。结果表明所构建的三框cDNA表达文库具有较高的重组率和库容量，为进一步酵母双杂交筛选与SS2毒力因子MRP互作的宿主蛋白奠定基础。
　　 溶菌酶释放蛋白（Muramidase-released protein，MRP）是SS2重要的毒力因子。利用泛素分离酵母双杂交系统，以MRP为诱饵蛋白从猪脑组织cDNA文库中筛选MRP的互作蛋白，探索MRP在SS2致病中的作用。经过诱饵构建、自激活验证、背景及文库筛选等一系列筛选步骤，得到两个与MRP相互作用的阳性克隆，两个基因分别与紧密连接蛋白5（Homo sapiens claudin5，NM_001130861）和突触泡蛋白(Homosapiens VAMP(vesicle-associated membrane protein)-associated protein A,BC002992)基因高度同源。

目录

声明

摘要

第一章 猪链球菌2型的研究进展

1 病原学

2 流行病学

3 临床症状

4 猪链球菌2型的毒力因子

4．1 荚膜多糖(Capsular polysaccharide，CPS)

4．2 溶菌酶释放蛋白(Muramidase-released protein，MRP)和胞外因子(Extracellular protein factor，EF)

4．3 猪溶血素(suislysin，SLY)

4．4 纤连蛋白结合蛋白(Fibronectin and fibrinogen-bining protein，FBPS)

4．5 谷氨酸脱氢酶(glutamate dehydrogenase，GDH)

4．6 IgG结合蛋白和44ku胞壁蛋白

4．7 磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)

4．8 毒力相关序列ORF2

4．9 其他可能的毒力因子

参考文献

第二章 酵母双杂交技术研究与应用进展

1 酵母双杂交系统的原理

2 酵母双杂交体系的发展及应用

2．1 针对核内蛋白的酵母双杂交系统

2．2 针对胞浆及膜蛋白的酵母双杂交系统

2．3 针对胞外及跨膜蛋白的酵母双杂交系统

3 酵母双杂交系统的缺陷

参考文献

第三章 猪链球菌2型omp40基因的分布及克隆表达

1 材料与方法

1．1 菌株和质粒

1．2 试剂与仪器

1．3 模板DNA的提取

1．4 引物设计及合成

1．5 omp40在猪链球菌中的分布

1．6 序列分析

1．7 omp40的克隆表达

1．8 OMP40免疫血清的制备

1．9 重组OMP40的Western blot分析

1．10 OMP40细胞定位

1．11 配基印迹结合试验

2 结果

2．1 omp40序列分析

2．2 omp40基因在不同猪链球菌中的分布

2．3 融合蛋白的表达及纯化

2．4 omp40基因编码胞壁蛋白

2．5 OMP40与人胶原蛋白Ⅰ型的结合

3 讨论

参考文献

第四章 猪链球菌2型ZY05719 omp40基因缺失株构建及特性分析

1 材料和方法

1．1 菌株、质粒及引物

1．2 主要试剂和仪器

1．3 ZY05719 omp40基因敲除突变株的构建和鉴定

1．4 突变株Δomp40、互补株CΔomp40和野毒株ZY05719生物学形状的比较

2 结果

2．1 重组质粒pSET4s∷omp40的鉴定

2．2 互补质粒的鉴定

2．3 基因缺失株的鉴定

2．4 质粒稳定性分析

2．5 生长形态的比较

2．6 生长曲线的比较

2．7 HEp-2的黏附测定

2．8 生物被膜的测定

2．9 胶原蛋白结合能力的测定

2．10 斑马鱼毒力的测定

3 讨论

参考文献

第五章 猪链球菌2型OMP40介导感染小鼠脑微血管内皮细胞研究

1 材料和方法

1．1 菌株及细胞株

1．2 菌株对小鼠脑微血管内皮细胞刺激

1．3 RNA样品的提取和检测

1．4 RNA扩增及标记

1．5 杂交、扫描及数据分析

2 结果

2．1 基因芯片分析

2．2 GO聚类分析

2．3 信号通路分析

3 讨论

参考文献

第六章 猪链球菌2型纤连蛋白及胶原蛋白结合蛋白的筛选

1 材料和方法

1．1 菌株和主要试剂

1．2 制备上清及胞壁蛋白

1．3 二维电泳

1．4 Western affinity blot

1．5 MALDI-TOF-MS和数据库检索

2 结果

2．1 二维电泳图谱

2．2 Collagen及Fn结合蛋白的鉴定

3 讨论

参考文献

第七章 MRP与猪脑组织互作蛋白的筛选

1 材料和方法

1．1 菌株、质粒、试剂及引物

1．2 Total RNA的提取

1．3 mRNA的分离

1．4 cDNA文库(Uncut型)的构建

1．5 cDNA文库(Uncut型)文库质量鉴定

1．6 Prey vector pPR3-N-R1R2构建

1．7 酵母双杂交cDNA文库的构建

1．8 酵母双杂交cDNA文库质量鉴定

1．9 诱饵质粒pDHB1-mrp的构建

1．10 酵母感受态细胞的制备和转化

1．11 Western blot检测pDHB1-mrp在酵母菌中的表达情况

1．12 功能性验证

1．13 3-AT筛选背景的确定

1．14 猪脑组织cDNA文库的转化和筛选

1．15 β-galactosidase活性的检测

1．16 候选阳性克隆质粒的提取、PCR扩增及测序

1．17 候选阳性克隆的酵母再验证

2 结果

2．1 猪脑组织mRNA分离与纯化结果

2．2 初级cDNA文库的鉴定结果

2．3 pPR3-N-DEST构建结果

2．4 酵母文库的鉴定

2．5 诱饵质粒pDHB1-mrp的构建与鉴定

2．6 Western blot检测pDHB1-mrp在酵母菌中的表达

2．7 功能性验证

2．8 3-AT筛选背景的确定

2．9 猪脑组织cDNA文库以及β-galactosidase活性的检测

2．10 插入片段的PCR扩增

2．11 候选阳性克隆的酵母再验证

3 讨论

参考文献

全文总结

致谢

博士期间发表及待发表论文