增硝营养调控不同硝响应型水稻品种根系生长的机制研究

摘要

水稻是我国主要粮食作物之一，氮素(N)是作物产量的重要养分限制因子并且影响整个生育周期的生长。目前水稻对N的吸收和利用效率成为人们研究关注的焦点。通常情况下，水稻生长在淹水条件下，铵(NH4+)成为水稻田土壤N的主要存在形态，然而水稻根系能分泌氧气，这些氧气能刺激根际土壤和根表硝化微生物的生长和繁殖，所以水稻根系实际上是处于NH4+和低浓度硝(NO3-)混合营养（即增硝营养）中。因此，水稻硝酸盐(NO3-)营养是水稻氮素营养重要的组成部分。中低浓度的局部供应的NO3-可以刺激旱地作物根系生长，而水稻生长在淹水土壤导致的养分比较均一的环境，关于NO3-对水稻根系生长调控的研究并未见报道，主要原因可能是人们认为淹水稻田土壤N营养以NH4+营养为主而忽略了NO3-营养。
　　 本研究利用氮效率和NO3-响应差异大的两个水稻品种（南光:氮高效-NO3-响应强;Elio:氮低效-NO3-响应弱）来深入研究增NO3-营养调控水稻系生长及其相关的生理机制。课题组前期多年多点的田间实验研究结果表明，在同一供氮水平下南光的籽粒产量显著高于Elio，因此把南光定义为氮高效水稻，而Elio定义为氮低效水稻。由于南光的千粒重显著小于Elio，导致南光苗期的生物量显著小于Elio。有意思的是，随着生育期的推进氮高效水稻南光的吸氮量和生物量逐渐赶上并超过氮低效水稻Elio。在温室水培条件下的研究表明，与全NH4+营养相比，增NO3-营养促进南光的利用效率增加。而水稻根系的发生和伸长与氮素吸收效率关系密切。因此本研究研究了增NO3-营养下不同生育时期南光根系的发生和伸长及其有关的机制，以期为阐明水稻氮高效的机制打下坚实基础。
　　 主要结果如下:
　　 1.通过利用水培试验方法，研究了两种铵硝配比(NH4+/NO3-为100/0和75/25)营养条件对4种不同NO3-响应型水稻品种苗期根系生物量、氮积累量以及根系形态参数进行评价，从中筛选出试验的供试材料。结果表明，在增NO3-营养(NH4+/NO3-为75/25)条件下，不同水稻品种对NO3-的响应不同。与全NH4+营养条件相比，增NO3-营养条件下的水稻品种南光(NO3-强响应)的根系干重和氮积累量显著增加，增幅达50％和79％;同时南光的根系总根长、总不定根长和总侧根长增幅均达到显著水平;不定根数、新根数和侧根数亦显著增加;平均不定根长和平均侧根长差异不显著;水稻品种上海97、辽粳和Elio(NO3弱响应型)在增硝营养培养下的根系不定根、新根和侧根的长度和数量差异均不显著，与上海97、辽粳相比较，Elio对NO3-的响应度最低。这表明NO3-强响应型水稻南光对NO3-响应主要体现在促进了根系的不定根和侧根的发生，进而促进了根系对氮素的吸收。
　　 2.在筛选到氮效率和NO3-响应差异大的两个水稻品种(南光和Elio)的基础上，通过系列NH4+/NO3-的梯度试验进一步深入研究增NO3-营养对水稻根系生长的影响及其相关生理机制。研究表明，与全NH4+营养相比，NH4+/NO3-为93/7和86/14处理下，NO3-强响应的水稻品种南光的地上部及根系生物量没有显著变化，当NH4+/NO3-为75/25时南光的地上部和根系的生物量增幅最大，然而根系的形态如侧根长和不定根长在NH4+/NO3-为为93/7时已显著增加。由于南光的千粒重小于Elio，在不同氮处理条件下培养5周时，Elio地上部、根系生物量及根系总长显著高于南光。培养10周时，增NO3-营养处理下的南光根系生物量及根系总根长已显著高于Elio。与全铵营养相比，增NO3-营养处理下南光根系、木质部伤流液及地上部的硝酸还原酶的活性显著提高，增幅依次为126％、513％和81％。南光倒1、2叶的生长素含量在增NO3-营养条件下也显著增加，且南光的倒1、2茎和冠根点的生长素浓度增幅更加显著，增幅分别为75％、50％和48％;表明增NO3-营养促进了南光地上部生长素的合成和由地上部向根系的极性运输。
　　 3.为了进一步研究不同硝响应型水稻根系的动态变化及其硝响应相关基因的表达对增NO3-营养的响应，采用两室分根盒的研究表明（一侧根系供全NH4+营养，另一侧根系供增NO3-营养），与全NH4+营养相比，增NO3-营养处理5天时南光侧根原基数量显著增加，处理7天时，南光侧根数显著增加，与此同时，增NO3-营养显著促进南光0-4 cm根段硝酸盐低亲和运输蛋白基因OsNRT1.1及0-4和4-8cm两根段OsMADS的表达;而增NO3-营养仅促进Elio0-4cm根段OsMADS的表达;通过10分钟的15N标记实验结果表明，与15N-NH4+营养相比，15N-NH4+/15N-NO3-=75/25处理下硝响应强的水稻品种南光吸收速率显著增加，与此同时，在增NO3-营养处理下南光的氮素同化酶（NRAmax、NRAact和GSA）显著提高，而NO3-响应弱的水稻品种Elio差异不显著。
　　 4.生长素(IAA)是植物体内重要的内源激素，对侧根的萌发和伸长起着重要作用。为了进一步研究增NO3-营养处理下不同硝响应型水稻根系生长素的动态变化及生长素极性运输相关基因的表达，采用DR5∶GUS的转基因材料和两室分根盒的水培方法研究了两种NH4+/NO3-(100/0、75∶25)营养条件对不同NO3-响应型水稻品种苗期生长素内流外流运输蛋白基因和根系生长素分布的影响。结果表明，培养7天时，与全NH4+营养相比，增NO3-营养促进了南光植株体内生长素从地上部向根系的极性运输;对NO3-弱响应型的水稻品种Elio在不同处理条件下差异不显著;与全NH4+营养处理相比，增NO3-营养条件下，对NO3-强响应的水稻品种南光的根系IAA浓度显著增加，增幅达24％，同时生长素在南光根系的分布发生变化，南光侧根区的生长素浓度显著增加。 Elio在两种处理条件下生长度浓度的差异不显著。RT-PCR的研究结果表明，OsPIN1a，b、OsPIN5a和OsPIN9的相对表达量在水稻根系不受N形态的调控，OsPIN1c和OsPIN2在南光和Elio根系均在增硝营养处理下上调，而OsAXR4、OsAUX1和OsPIN5b的相对表达量仅在南光根系受增NO3-营养的影响表达上调。
　　 5.细胞分裂素(CTK)被认为是与N素形态关系较为密切的激素，CTK主要在根系合成，通过木质部运输到地上部。为了进一步研究增NO3-营养处理下不同硝响应型水稻根系CTK合成及运输，本试验利用控制条件下的水培试验方法，研究了两种NH4+/NO3-(100/0和75/25)营养条件对不同NO3-响应型水稻品种苗期体内细胞分裂素含量、细胞分裂素合成基因OsIPT家族和叶片形态的影响。研究表明，培养14天时，与全NH4+营养条件相比，增NO3-营养处理下，南光根系和叶片细胞分裂素总量显著增加，增幅分别为34％和25％;对NO3-弱响应型的水稻品种Elio在不同处理条件下差异不显著;另外，与全NH4+营养条件相比，增NO3-营养主要促进了南光根系OsIPT3基因的表达增强，而Elio差异不显著;于此同时，增NO3-营养促进了NO3-响应强的水稻南光的第一完全展开叶的发育。从本试验的结果可推论，增NO3-营养促进了硝响应强的水稻品种南光根系细胞分裂素的合成以及从根系向地上部的运输，从而长距离调节水稻叶片的生长和发育。
　　 综上所述，与全NH4+营养相比，增NO3-营养处理7天时氮高效水稻南光侧根的发生显著增加，处理5周时南光的不定根和侧根的发生均显著增加，处理10周时南光根系的生物量超过氮低效水稻Elio。增NO3-营养促进根系的生长后进而促进水稻体内氮素的吸收。生长素对于植物根系的生起着重要作用。与全NH4+营养相比，增NO3-营养处理5天时氮高效水稻南光根系的生长素浓度显著增加。利用DR5∶GUS转基因材料和分根实验的结果表明，增NO3-营养处理促进了生长素从地上部向根系的极性运输，且生长素在南光根系的分布改变。同时增NO3-营养显著上调南光根系更多的生长素内流和外流蛋白基因的表达。与全NH4+营养相比，增NO3-营养还促进了根系细胞分裂素的合成与运输。

目录

声明

论文说明

摘要

缩略语

第一章 文献综述

1．1 水稻氮素营养和氮肥管理是中国农业生产中的重要组成部分

1．2 水稻根际的硝化作用

1．3 水稻氮素吸收的生理特性

1．4 水稻氮素吸收分子机制

1．4．1 NO3-吸收的分子机制

1．4．2 NH4+吸收的分子机制

1．5 水稻根系生长对NO3-营养的响应及其机制

1．5．1 NO3-对侧根生长发育的局部刺激作用

1．5．2 侧根的生长发育机制

1．5．3 水稻侧根生长对NO3-营养的响应

1．6 NO3-促进植物根系生长的可能机制

1．6．1 NO3-的营养作用

1．6．2 NO3-与植物体内糖类等碳水化合物的作用

1．6．3 NO3-与植株内源激素(IAA)

1．6．4 NO3-与植株内源激素(CTK)

1．6．5 NO3-的信号作用

1．7 研究思路

1．8 技术路线

第二章 增硝营养对不同硝响应型水稻品种苗期根系生长的影响

2．1 引言

2．2 材料与方法

2．2．1 品种选择

2．2．2 试验设计

2．3 测定项目

2．3．1 根系形态动态测定

2．3．2 干重及含氮量测定

2．3．3 数据处理

2．4 结果与分析

2．4．1 生物量和氮积累量

2．4．2 根系形态

2．5 讨论

第三章 不同铵硝比调控水稻品种根系生长的生理效应

3．1 引言

3．2 材料与方法

3．2．1 试验材料

3．2．2 试验设计

3．3 测定项目及方法

3．3．1 植株干重、含氮量及硝酸盐含量的测定

3．3．2 根系NRA的测定

3．3．3 水稻总根长、侧根数等根系参数的测定

3．3．4 根系IAA浓度的测定

3．3．5 可溶性糖含量的测定

3．3．6 数据处理

3．4 结果与分析

3．4．1 植株生长

3．4．2 根系形态

3．4．3 氮状况和硝酸还原酶活性

3．4．4 可溶性糖浓度

3．4．5 生长素浓度

3．5 讨论

第四章 不同硝响应型水稻品种根系动态变化对增硝营养的响应

4．1 引言

4．2 材料与方法

4．2．1 试验材料

4．2．2 试验设计

4．3 测定项目及方法

4．3．1 水稻总根长、侧根数等根系参数的测定

4．3．2 植株总RNA的制备

4．3．3 cDNA合成

4．3．4 引物设计

4．3．5 根系NRA的测定

4．3．6 根系GSA的测定

4．3．7 15N吸收速率的测定

4．3．8 数据处理

4．4 结果与分析

4．4．1 根系长度的动态变化

4．4．2 侧根发育

4．4．3 不定根发育

4．4．4 根原基

4．4．5 受NO3-诱导的调节基因的表达

4．4．6 15N吸收速率、氮素同化酶(NRA和GSA)

4．5 讨论

第五章 增硝营养对不同硝响应型水稻品种内源生长素的影响

5．1 引言

5．2 材料与方法

5．2．1 试验材料

5．2．2 试验设计

5．3 测定项目及方法

5．3．1 植株总RNA的制备

5．3．2 cDNA合成

5．3．3 DR5载体

5．3．4 水稻转化

5．3．5 引物设计

5．3．6 水稻GUS组织特异性表达分析

5．3．7 根系IAA浓度的测定

5．3．8 数据处理

5．4 结果与分析

5．4．1 根系生长素的含量和分布

5．4．2 OsPINs，QsAUX和OsAXR4表达量

5．5 讨论

第六章 增硝营养对不同硝响应型水稻品种内源细胞分裂素的影响

6．1 引言

6．2 材料与方法

6．2．1 试验材料

6．2．2 试验设计

6．3 测定项目及方法

6．3．1 CTK的测定

6．3．2 植株总RNA的制备

6．3．3 cDNA合成

6．3．4 引物设计

6．4 结果与分析

6．4．1 CTK含量

6．4．2 OsIPTs的表达

6．4．3 叶片形态

6．4．4 叶片细胞

6．5 讨论

全文结论

创新点

参考文献

附录

博士期间发表文章

致谢