萤火虫荧光素酶及酿酒酵母ATP硫酸化酶在大肠杆菌中的表达、纯化及其应用

摘要

荧光素酶是由一条多肽链组成的高效生物催化剂。在ATP、Mg2+、O2等适宜的条件下，能够以荧光素为底物发生催化反应并发出荧光。本文将北美萤火虫荧光素酶基因克隆到大肠杆菌中，用随机突变的方法未筛选到对酸碱或温度耐受性增强的荧光素酶突变体。分析酶的结构，发现其第232位的疏水性异亮氨酸的周围负电荷氨基酸太多，将异亮氨酸定点突变成带正电的赖氨酸后，连到表达载体pET30a(+)上，导入表达菌株BL21(DE3)中，获得高效表达萤火虫荧光素酶的重组菌Q2/pET30a-luc、Q3/pET30a-luc-I232K，经镍柱纯化出目的蛋白后，测得突变体Luc(I232K)比活力(4.68×1012 RLU/mg)较Luc比活力(1.94×1012 RLU/mg)高2.41倍。
　　 本实验发现底物ATP及荧光素对两种荧光素酶的反应动力学曲线均是s型的。Mg2+及CoA可以提高两种酶的活性，CoA还可延长发光时间，其最适浓度分别为10mM、20μM。本文还探究了几种不同的酶保存液对两种荧光素酶的影响。2.0 mMEDTA、1.0 mM DTT、30μg/mL BSA是保护这两种酶最适宜的条件。Luc在(NH4)2SO4或TritonX-100分别为1 mM、0.1％时存活率最高，而突变体Luc(I232K)对(NH4)2SO4或TritonX-100耐受性更高，最适宜的浓度分别为2mM、0.15％。但这两种保护剂的浓度继续升高时会使两种酶的活性下降。突变体Luc(I232K)较Luc在pH5时活性更高，活性pH范围更广。其最适反应温度范围(22℃～28℃)较Luc(22℃～25℃)更宽。Luc(I232K)长时间存放于-20℃、4℃、22℃时，其酶存活率比Luc高。40℃保温5 min后，Luc(I232K)、Luc酶存活率分别为77％、8.6％，放置1h后，Luc完全失活，Luc(I232K)酶存活率10％。
　　 将以上纯化的突变体Luc(I232K)应用于微生物细胞ATP含量的测定中，使用季铵盐类表面活性剂苯扎氯铵(BAC)提取细胞内ATP，其浓度在低于0.03％时，对荧光素酶活性干扰小，苯扎氯铵提取不同菌的ATP的最适浓度和时间为:霍乱弧菌0.02％、2 min，大肠杆菌0.03％、3 min，恶臭假单胞菌0.02％、3 min，枯草芽孢杆菌0.01％、2 min。本实验发现ATP浓度与发光强度相关性良好，同时细菌数目与生物发光强度在一定范围内也有良好的相关性，通过测定发光值推算出霍乱弧菌ATP含量约为0.24～0.45×10-18 mol/个，大肠杆菌ATP含量约为0.65～1.27×10-17 mol/个，恶臭假单胞菌ATP含量约为0.14～0.2×1016 mol/个，枯草芽孢杆菌ATP含量约为0.08～0.25×10-16mol/个，实验测得每种细菌的不同生长阶段ATP含量基本一样。将突变体Luc(I232K)应用到纳米材料ZnO对恶臭假单胞菌细胞活性的影响中，结果是纳米材料ZnO虽促进其生物膜形成，但对其细胞活性无影响，也可能是仪器检测ATP的下限不够低、ATP提取剂苯扎氯铵对荧光素酶Luc(I232K)活性有少许抑制作用及本实验方法不能用于检测细胞内ATP浓度的极其微量的变化。
　　 将萤火虫荧光素酶与ATP硫酸化酶偶联可以应用于PPi测定、DNA聚合酶活性测定等方面。通过将酿酒酵母ATP硫酸化酶基因met3连到表达载体pET30a(+)上，导入表达菌株BL21(DE3)中，获得了高效表达ATP硫酸化酶的重组菌Q4/pET30a-met3。将经镍亲和层析纯化后的ATP硫酸化酶与荧光素酶Luc(I232K)偶联来检测ATP硫酸化酶的活性及PCR产物中焦磷酸的释放量来评价DNA聚合酶的活性。纯化得到ATP硫酸化酶比活力为2.79×103 U/mg.实验表明放置在4℃及28℃保存1个月后DNA聚合酶活性均下降。

目录

声明

摘要

符号与缩略语说明

第一章 文献综述

1 荧光素酶简介

1．1 萤火虫荧光素酶结构

1．2 萤火虫荧光素酶催化发光的原理

2 萤火虫荧光素酶的研究历史及现状

3 萤火虫荧光素酶的稳定性

4 基因重组萤火虫荧光素酶在大肠杆菌中的表达

4．1 表达载体的选择

4．2 蛋白质的分离纯化

5 萤火虫荧光素酶的应用

5．1 作为报告基因的应用

5．2 研究蛋白质之间作用

5．3 在医学上的应用

5．4 在细胞活性分析中的应用

5．5 在微生物检测上的应用

6 ATP硫酸化酶的研究

6．1 ATP硫酸化酶的结构

6．2 ATP硫酸化酶的功能研究

6．3 ATP硫酸化酶的应用

参考文献

第二章 萤火虫荧光素酶在大肠杆菌中的表达、纯化及其应用

第一节 萤火虫荧光素酶在大肠杆菌中的表达、纯化及性质的研究

1 材料与方法

2 结果与分析

3 小结与讨论

第二节 萤火虫荧光素酶在微生物细胞ATP含量测定上的应用

1 材料与方法

2．结果与分析

3 小结与讨论

参考文献

第三章 酿酒酵母ATP硫酸化酶在大肠杆菌中的表达、纯化及其应用

1 材料与方法

1．1 供试菌株与质粒

1．2 培养基与培养条件

1．3 抗生素与浓度

1．4 试剂

1．5 实验方法

2 结果与分析

2．1 克隆载体的构建

2．2 表达载体的构建

2．3 重组ATPS的诱导表达

2．4 重组ATPS的表达形式

2．5 重组ATPS的开始诱导的菌液浓度的优化

2．6 重组ATPS的纯化

2．7 重组ATPS含量及活性检测

2．8 APS及ATP硫酸化酶用量的选择

2．9 PPi标准曲线及检测极限的确定

2．10 PCR产物焦磷酸含量测定及DNA聚合酶活性比较

3 小结与讨论

参考文献

全文总结

附录 文中所用的试剂配方

致谢